綠茶及其提取物與抗生素合用抗MRSA的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴了解來自汕頭和北京地區(qū)的67株MRSA的耐藥情況及耐藥機(jī)制，并分析耐藥表型與基因型的一致情況。⑵篩選綠茶抗MRSA的主要成分，觀察綠茶和提取物與抗生素的協(xié)同抗菌情況，并進(jìn)一步探討綠茶浸出物對(duì)MRSA的抗菌機(jī)制。⑶測定Ecg/EGCg與β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)MRSA的協(xié)同抗菌作用，并研究Ecg/EGCg與β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)MRSA的協(xié)同抗菌作用機(jī)制。⑷研究Ecg與四環(huán)素對(duì)MRSA的協(xié)同抗菌作用并探討其機(jī)制。
　　 方法：①

2、以瓊脂稀釋法測定24種抗菌藥物對(duì)MRSA的體外抗菌活性，PCR擴(kuò)增MRSA的耐藥基因，nitrocefin測定細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況。②分別測定綠茶、青茶、白茶、紅茶和黑茶對(duì)MRSA的MIC，并比較它們對(duì)MRSA的抗菌效果；測定茶葉的主要成分茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶色素和咖啡因?qū)RSA的MIC，推測綠茶抗MRSA的主要成分。用紙片擴(kuò)散法測定綠茶浸出物及其提取物與抗生素抗MRSA的協(xié)同作用。以滲透試驗(yàn)檢測MRSA 對(duì)綠茶的蒸餾水和N

3、aCl 溶液的耐受情況。HPLC 測定綠茶及其提取物對(duì)頭孢唑啉在金葡菌菌體內(nèi)蓄積量的影響。③以微量稀釋法測定Ecg、EGCg和β-內(nèi)酰胺類抗生素的體外協(xié)同抗MRSA作用。以RT-PCR技術(shù)檢測Ecg、EGCg對(duì)lytM、lgrA基因表達(dá)的影響，并監(jiān)測細(xì)菌自溶酶活性的變化。WB法測定EGCg 對(duì)MRSA的PBP2a 蛋白的影響。用超聲破碎法提取β-內(nèi)酰胺酶，測定Ecg和EGCg對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制情況，并與三唑巴坦的抑酶作用進(jìn)行比較。④以

4、微量稀釋法測定Ecg與四環(huán)素的體外抗MRSA協(xié)同作用。用PCR技術(shù)篩選tetK基因陽性株和陰性株，以熒光法測定Ecg/EGCg 對(duì)tetK外排泵的抑制作用。
　　 結(jié)果：⑴67株MRSA除了對(duì)氯霉素和多西環(huán)素的耐藥率較低，分別為3％和7.5％，對(duì)萬古霉素、米諾環(huán)素和利凡諾100％敏感外，對(duì)利福平的耐藥率為52.2％，對(duì)四環(huán)素的耐藥率為77.6％，而對(duì)于其它包括青霉素、第1-4代頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和

5、磺胺類的耐藥率均在80～90％以上，氨芐西林加酶抑制劑以后則耐藥程度有所降低。qacA/B 、mecA、tetM、NorA、gyrA、aac (6’)/aph(2”)、aph (3’) III和β-lactamase檢出率分別為11.9％、95.5％、70.1％、4.5％、10.4％、82.1％、73.1％ 和92.5％ ，未檢出qacC 、ant (6) - Ⅰ、ant (2″)-Ⅰ、VanA和VanB耐藥基因。67株MRSA均攜帶有

6、多種耐藥基因：同時(shí)攜帶2種耐藥基因的有7株，3種的有10株，4種的有11株，5種的29株，6種的10株。⑵綠茶浸出物對(duì)MRSA的MIC范圍為0.125％～0.5％；青茶浸出物為0.125％～0.5％；白茶浸出物為0.0625％～0.25％；紅茶浸出物為0.5％；黑茶浸出物為0.25～0.5％。茶多酚為128～256μg/ml；茶色素為256～512μg/ml；茶多糖為512～1024μg/ml；茶皂素和咖啡因的MIC 均大于1024μg

7、/ml。綠茶浸出物對(duì)青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢替唑、米諾環(huán)素和四環(huán)素的抗MRSA 作用有增效作用，與紅霉素和氯霉素呈無關(guān)作用，與環(huán)丙沙星呈拮抗作用。茶多糖、茶皂素、茶色素、咖啡因與苯唑西林抗MRSA呈無關(guān)作用。茶多酚、Ecg和EGCg與苯唑西林抗MRSA有增效作用。EC與苯唑西林抗MRSA呈無關(guān)作用。EC有進(jìn)一步加強(qiáng)Ecg 對(duì)苯唑西林的抗MRSA作用。綠茶浸出物促進(jìn)MRSA在蒸餾水和NaCl溶液中的破壞。經(jīng)過綠茶浸出液、

8、茶多酚、EC、Ecg和EGCg預(yù)處理的金葡菌體內(nèi)蓄積的頭孢唑啉明顯增多。⑶50μg/ml 的Ecg/EGCg均能增強(qiáng)苯唑西林、頭孢拉定、頭孢呋辛、美羅培南對(duì)MRSA的抗菌作用，其中與美羅培南的協(xié)同效果比苯唑西林、頭孢拉啶和頭孢呋辛明顯。在同等濃度下，Ecg與β-內(nèi)酰胺類抗生素的協(xié)同效果比EGCg明顯。隨著Ecg和EGCg濃度的增高，MRSA的lytM、lgrA基因表達(dá)上調(diào)。而且EGCg濃度增加可導(dǎo)致產(chǎn)生的自溶酶增多。25、50和100μ

9、g/ml EGCg可使MRSA-2的PBP2a蛋白表達(dá)下調(diào)。三唑巴坦對(duì)金葡菌β-內(nèi)酰胺酶有很強(qiáng)的抑制作用，濃度為256μg/ml時(shí)可完全抑制金葡菌的β-內(nèi)酰胺酶，而EGCg/Ecg對(duì)金葡菌β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用很微弱，濃度為409.6μg/ml的時(shí)，金葡菌β-內(nèi)酰胺酶仍能使nitrocefin變色。⑷Ecg對(duì)MRSA和ATCC25923的MIC均為256μg/ml；四環(huán)素對(duì)MRSA的MIC值為2～128μg/ml，對(duì)ATCC25923為

10、2μg/ml。合用25μg/ml的Ecg與四環(huán)素后，15株MRSA中有5株呈協(xié)同作用，7株呈相加作用，2株呈無關(guān)作用，1株呈拮抗作用。ATCC25923 呈相加作用。經(jīng)Ecg處理四環(huán)素釋放曲線低于未經(jīng)Ecg 處理的曲線。
　　 結(jié)論：①67株MRSA耐藥情況嚴(yán)重，并同時(shí)攜帶多種耐藥基因。②五種茶葉對(duì)MRSA均有一定的抗菌作用，抗菌較強(qiáng)的是白茶和綠茶。綠茶浸出物能增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素對(duì)MRSA的抗菌作用。綠茶抗MRSA主

11、要成分為茶多酚，而且只有茶多酚才能增強(qiáng)苯唑西林對(duì)MRSA的抗菌作用。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)，茶多酚中的兩個(gè)單體Ecg EGCg能增強(qiáng)苯唑西林對(duì)MRSA的抗菌作用。而EC能進(jìn)一步加強(qiáng)Ecg與苯唑西林對(duì)MRSA協(xié)同抗菌作用。通過綠茶的蒸餾水和NaCl溶液滲透試驗(yàn)，我們推斷綠茶浸出物抗MRSA的機(jī)制可能與破壞細(xì)菌細(xì)胞壁有關(guān)。綠茶浸出物、茶多酚、EC、Ecg 和EGCg均能促進(jìn)頭孢唑啉在MRSA和ATCC菌體內(nèi)蓄積。③Ecg/EGCg與β-內(nèi)酰胺類抗生