紅樹林植物海芒果來源的抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，僅次于胃癌和食管癌。由于肝癌的易轉(zhuǎn)移性，雖然臨床上采取了手術(shù)、非手術(shù)方式的藥物治療及手術(shù)與藥物治療相結(jié)合的療法，但治療效果始終不能令人滿意。手術(shù)切除是目前治療肝癌的重要方法，但手術(shù)切除率低及術(shù)后易復(fù)發(fā)等因素嚴(yán)重影響著治療效果。而臨床上普遍應(yīng)用的化療藥物選擇性及敏感性均較差，因而從天然活性物質(zhì)中尋找并開發(fā)有效低毒的肝癌治療藥物變得非常迫切。海芒果的果實(shí)有劇毒，以核仁最毒，

2、從中提取的化學(xué)成分-強(qiáng)心苷目前已作為主要的抗心衰藥物而廣泛應(yīng)用于臨床，而對(duì)海芒果中抗腫瘤活性成分的研究甚少。 本課題的目的就是：從紅樹林植物海芒果(Cerbera manghas L．)來源的化合物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)理。 方法：利用MTT法研究從海芒果中提取的化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞張氏肝(Chang Liver)增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀Propidium Iodide(P

3、I)單標(biāo)法檢測(cè)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；利用Annexin V-FITC和PI雙染后流式細(xì)胞儀分析，及DNA片斷化分析法(DNA fragment assay)進(jìn)一步證實(shí)化合物是否具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；利用熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)觀察化合物作用細(xì)胞后，對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響；利用Caspase檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化合物作用細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞Caspase-3，-8，-9酶活力的影響；采用流式細(xì)胞儀

4、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的anti-human Fas抗體和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的anti-human FasL抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fas和FasL的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果表明，海芒果果實(shí)提取的化合物GHSC-71-GHSC-102對(duì)HepG2細(xì)胞有不同程度的抑制作用，其中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物GHSC-71最敏感，化合物GHSC-71在25μg/ml的濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)到了98％；進(jìn)一步在化合物GHSC-71對(duì)He

5、pG2細(xì)胞增殖影響的研究中發(fā)現(xiàn)，GHSC-71對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，在作用HepG2細(xì)胞12h，24h，48h和72h后，IC50分別為：2.34±0.08，0.13±10.01，0.15±0.01，0.06±0.01μg/ml，但對(duì)人正常肝細(xì)胞Chang Liver顯示出較低的毒性。流式細(xì)胞分析顯示，化合物GHSC-71作用HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯在S期和G2/M期，具有時(shí)間依賴性。流

6、式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙標(biāo)檢測(cè)凋亡率的結(jié)果也顯示隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，早期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例也不斷增加，凋亡作用明顯。DNA片斷化分析結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，GHSC-71處理組作用HepG2細(xì)胞48h后出現(xiàn)明顯的梯形條帶，充分證實(shí)化合物GHSC-71具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。Real-timeRT-PCR結(jié)果表明，化合物GHSC-71作用HepG2細(xì)胞后24小時(shí)后Caspase-3，-8，-9和fas凋亡相關(guān)基

7、因mRNA表達(dá)水平均有明顯升高。在Caspase-3，-8，-9酶活力檢測(cè)中，當(dāng)0.1μg/ml GHSC-71處理HepG2細(xì)胞后Caspase-3的活性升高比較明顯，在處理3h，6h，12h和24h后Caspase-3酶活性分別為對(duì)照組的3.33倍(P＜0.05)，5.26倍(P＜0.05)，12.25倍(P＜0.01)，23.84倍(P＜0.01)。Caspase-8，Caspase-9酶的活性在0.1μg/ml GHSC-71處

8、理1h后就開始升高，分別為對(duì)照的1.6倍(P＜0.01)和1.45倍(P＜0.05)。雖然Caspase-8，Caspase-9酶的活性隨著處理時(shí)間的增加有所波動(dòng)，但與對(duì)照相比，Caspase-8，Caspase-9酶的活性總體都呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)中我們又發(fā)現(xiàn)GHSC-71處理后，能使外源性死亡受體Fas及其配體FasL的蛋白水平相應(yīng)增加。 結(jié)論：本課題中，我們發(fā)現(xiàn)從紅樹林植物海芒果果實(shí)中提取的一系列皂苷類化合物(GHSC-71-