Tsc1是維持巨噬細(xì)胞生存和功能的主要調(diào)節(jié)子.pdf

1、課題一、Tsc1是維持巨噬細(xì)胞生存和功能的主要調(diào)節(jié)子
　　背景:結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物1(Tsc1)和結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物2(Tsc2)結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物可以通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和能量的穩(wěn)定，TSC1和TSC2功能的丟失可引起mTORC1活性的升高，進(jìn)而引起細(xì)胞體積增大、增殖能力增強(qiáng)。有研究稱Tsc1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2的極化，但對(duì)于Tsc1對(duì)巨噬細(xì)胞的功能和自穩(wěn)的精確調(diào)控作用尚不明確，本研究

2、我們揭示Tsc1對(duì)于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的生存、生長、遷移和吞噬功能具有十分重要的作用。
　　材料與方法:我們將由Lysozyme啟動(dòng)子控制表達(dá)Cre重組酶的LysMCre鼠與Tsc1 flox/flox鼠交配獲得髓系細(xì)胞特異性的Tsc1條件性敲除鼠（LysMCreTsc1 flox/flox）;PCR鑒定鼠的基因型，westem blot鑒定鼠巨噬細(xì)胞Tsc1蛋白的敲除情況;巨噬細(xì)胞的凋亡和生長由流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR進(jìn)行檢測;巨噬細(xì)

3、胞精氨酸酶活化由QuantiChromTM arginase assay kit進(jìn)行檢測;M1和M2相關(guān)的基因的mRNA的表達(dá)由RT-PCT進(jìn)行檢測;巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞活化的功能通過CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)3天后CD4+T細(xì)胞的活化進(jìn)行鑒定;巨噬細(xì)胞的吞噬功能由VybrantTMphagocytosis assay試劑盒進(jìn)行檢測;巨噬細(xì)胞的遷移由Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測;脾臟細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞Foxp3的染色是通過Treg檢

4、測試劑盒進(jìn)行。
　　結(jié)果:Tsc1 KO鼠巨噬細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞變大，腹腔注射Rapa可部分抑制Tsc1缺陷引起的巨噬細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞生長;在穩(wěn)定和炎癥狀態(tài)下，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞在穩(wěn)定和誘導(dǎo)作用下M1和M2特性均較WT巨噬細(xì)胞高，抑制mTORC1部分逆轉(zhuǎn)了Tsc1缺陷引起的巨噬細(xì)胞的M2和M1的變化;Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞CCR2和CCR5趨化受體表達(dá)降低、遷移能力下降、趨化因子升高，抑制mTORC1部分逆轉(zhuǎn)了Tsc1缺陷引起

5、的巨噬細(xì)胞的趨化因子和趨化受體的變化;另外，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞的吞噬能力和產(chǎn)生活性氧(ROS)的能力增加;與Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞的增殖和活化功能減弱。
　　結(jié)論:
　　1) Tsc1促進(jìn)巨噬細(xì)胞的生存、抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，并且這兩種作用是與mTORC1的活性有關(guān)。CD71和CD98可能參與了Tsc1調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞的生長;
　　2) Tsc1促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1和M2的特性，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞

6、在穩(wěn)定狀態(tài)下，分別增高了M1和M2的特性。在LPS和IL-4刺激下，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞分布增高了M1和M2的極化特性;
　　3) Tsc1促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞的CCR2和CCR5的趨化受體表達(dá)降低，CCL2趨化引起的遷移能力降低。另外，Tsc1缺陷的巨噬細(xì)胞趨化因子表達(dá)升高。Tsc1抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的活化;
　　4) Tsc1 KO鼠引起自發(fā)的淋巴組織增生性的疾病

7、。脾臟和淋巴結(jié)增大，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞活化嚴(yán)重。另外，鼠的體重沒有明顯的變化。
　　課題二全反式維甲酸促進(jìn)多能干細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化
　　目的:多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(ES)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)，作為一類具有無限自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，能進(jìn)一步分化為多種類型的細(xì)胞。MSC臨床應(yīng)用前景廣闊，是細(xì)胞替代治療和組織工程的首選種子細(xì)胞，是移植領(lǐng)域和自身性免疫疾病治療的研究熱點(diǎn)。探索全反式維甲酸(

8、RA)和SB431542對(duì)胚胎干細(xì)胞(ES)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)樣細(xì)胞的影響。
　　方法:將培養(yǎng)的鼠ES和iPS根據(jù)不同的分化條件分為對(duì)照組、SB431542組及RA組不同濃度組，對(duì)照組為DMEM完全培養(yǎng)基，SB431542組為DMEM完全培養(yǎng)基中含10μM的SB431542，RA組的DMEM完全培養(yǎng)基中含RA濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40 nM。分化培養(yǎng)4d后觀察細(xì)胞形態(tài)，流式

9、細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105和干細(xì)胞抗原1（Sca-1）的表達(dá)，以CD105+細(xì)胞和Sca-1+細(xì)胞的比例確定iPS和ES向MSC分化的程度。
　　結(jié)果:
　　1)小鼠ES和iPS在ESGRO-2i培養(yǎng)基里生長較好。ES分化4d后，對(duì)照組和SB431542組ES和iPS分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞，在含有不同濃度RA的培養(yǎng)基中ES和iPS可有效分化為纖維狀細(xì)胞;
　　2)ES分化4d后，SB431542組Sca-1+細(xì)胞比例

10、顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，CD105+細(xì)胞比例與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在RA濃度為0.05、0.10、0.20、0.40 nM組中，ES分化的CD105+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組和SB431542組(P＜0.05)，Sca-1+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但與SB431542組比較顯著降低(P＜0.05); RA濃度為0.20 nM組的CD105+和Sca-1+細(xì)胞比例顯著高于RA濃度為0.05、0

11、.10、0.40 nM組(P＜0.05);
　　3)iPS分化4d后，SB431542組CD105+細(xì)胞和Sca-1+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。在RA濃度為0.05、0.10、0.20、0.40 nM組中，iPS分化的CD105+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組和SB431542組(P＜0.05)，Sca-1+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但與SB431542組比較均顯著降低(P＜0.05); RA濃度為0.20 n