結(jié)節(jié)性硬化癥TSC1、TSC2基因突變分析及產(chǎn)前診斷.pdf

1、出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構、功能或代謝異常，包括先天肢體或器官畸形、遺傳代謝缺陷、先天功能殘疾、免疫性疾病、智力低下等。其造成因素多種多樣，有遺傳因素、環(huán)境因素，或二者共同作用致病。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，孕產(chǎn)婦、兒童死亡率逐步降低，出生缺陷也日益成為突出的公共衛(wèi)生問題甚至是社會問題。中國是人口大國，也是出生缺陷的高發(fā)國家之一，出生缺陷已成為影響中國優(yōu)生優(yōu)育和出生人口健康素質(zhì)的重大問題，也嚴重影響社會主義和諧社會的建設。它不僅是導

2、致早期自然流產(chǎn)、圍產(chǎn)兒死亡、嬰幼兒死亡以及先天殘疾的重要原因，也嚴重危害兒童的生存和生命質(zhì)量，影響家庭幸福，造成巨大的社會和家庭經(jīng)濟負擔。出生缺陷監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，中國出生缺陷總發(fā)生率約為5.6％（中國出生缺陷防治報告，2012）。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球低收入國家的出生缺陷發(fā)生率為6.42％，中等收入國家為5.57％，高收入國家為4.72％，中國出生缺陷發(fā)生率與世界中等收入國家的平均水平接近，但由于人口基數(shù)大，每年新增出生缺陷病例總數(shù)龐大

3、。而產(chǎn)前診斷是杜絕和減少出生缺陷唯一有效的方法。
　　結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous Sclerosis Complex，TSC)是一種較為常見的出生缺陷，其發(fā)病率約為1/6000-10000。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是導致死亡的主要原因，腎臟疾病為第二位原因。其臨床癥狀多變，從皮膚色素脫失斑，癲癇，智力低下，自閉癥，到腎臟、大腦、心臟、肺等器官的錯構瘤損害，嚴重程度無法預測。盡管有明確的臨床診斷標準，但在實際應用中仍具有一定困難。對于年

4、輕患者，尚缺乏典型的臨床癥狀，或者具有嚴重的臨床癥狀但缺乏特異性，如癲癇、智力低下、自閉癥，此時應選擇基因檢測來確診。胎兒期雖可通過超聲心動圖檢出心臟橫紋肌瘤，磁共振成像（MR工）檢出室管膜下結(jié)節(jié)，但該臨床癥狀出現(xiàn)時間不確定，且影像學作為輔助檢查手段存在非特異性，往往不能得到確診結(jié)果。因此，產(chǎn)前診斷應以基因檢測做為首選方法。TSC1、TSC2基因比較大，致病突變數(shù)量多且無突變熱點存在，基因檢測非常復雜。經(jīng)過40年的發(fā)展，測序技術經(jīng)歷了從

5、第一代到第三代的演變，通量和百萬堿基測序費用也越來越接近臨床的要求。圍繞速度、通量、價格這三個因素，一般將測序技術分為3代，而將第二、第三代測序技術統(tǒng)稱為新一代高通量測序技術。第一代核酸測序技術（Sanger測序法）檢測和分析過程非常耗費人力、費時、效率低。對電泳分離技術的依賴，使得該測序系統(tǒng)無法再進一步擴大通量和微量化。高通量測序高度平行化，即成千上萬個測序反應可以在一個平臺同時進行，且反應體系非常小，在很短的時間內(nèi)獲得大量的堿基信息

6、，費用也大大降低。
　　目的:對TSC先證者進行基因突變檢測，并在基因診斷結(jié)果明確的基礎上應用于產(chǎn)前診斷。
　　方法:對臨床確診、可疑TSC的患者或產(chǎn)前超聲異常可疑TSC的胎兒共13個家系，采用高通量測序平臺對TSC相關基因(TSC1、TSC2)外顯子及其上下游10bp的非編碼區(qū)進行檢測，確定基因突變位點。在突變位點上下游設計擴增引物，采用Sanger測序法對先證者及其家系成員進行測序驗證，分析突變來源，并復習文獻，最后對患

7、病家系行相應基因突變位點的產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷結(jié)果為陰性的家系，胎兒娩出后行臍血相應基因突變位點Sanger測序，以驗證產(chǎn)前診斷的準確性。
　　結(jié)果:13個家系均檢出基因突變，其中1例TSC1基因突變，12例TSC2基因突變，已知致病突變10例，新發(fā)可疑致病突變3例。12個家系行產(chǎn)前診斷，其中陽性2例，陰性10例，陽性病例夫婦最終決定終止妊娠，陰性病例胎兒娩出后臍血相應基因突變位點測序與產(chǎn)前一致。
　　結(jié)論:TSC2基因c.2

8、415-2416insGT、c.3981-3982insA、c.4013-4014delCA為新發(fā)可疑致病突變，均為TSC2的框移突變，不僅豐富了TSC基因突變譜，而且給突變蛋白細胞模型和動物模型的進一步驗證提供了資料。且成功對12個TSC家系行產(chǎn)前基因診斷，基因位點包括TSC1基因c.2074C＞T，TSC2基因c.1832G＞C、c.5227C＞T、c.2713C＞T、c.2415-2416insGT、c.3352C＞T、c.401