Apelin對缺血—再灌注損傷導致的心臟功能障礙的保護作用及機制研究.pdf

1、背景與目的
　　本實驗室于2008年發(fā)現(xiàn)Apelin能夠增強心肌細胞SERCA功能并且增加鈣瞬變幅度。本研究在以上研究基礎(chǔ)上進一步研究Apelin對心肌缺血再灌注的保護作用。不同于已有的大量關(guān)于缺血再灌注的保護作用的研究,本研究著重從心肌的功能保護方面進行研究。因為我們相信缺血再灌注損傷除了直接導致心肌細胞凋亡、自噬或者壞死以外,還會導致一部分細胞功能障礙。這部分細胞并沒有立即死亡,仍在發(fā)揮作用,但細胞的許多生化功能和收縮功能都受

2、到了影響。這種功能方面的研究并不多,但我們認為細胞這時的功能極為重要,一方面良好的細胞功能可以保證即刻的心臟收縮功能,減少心律失常的發(fā)生,在臨床上也就能減少患者即刻的死亡率。另一方面良好的細胞功能可以保證細胞的正常生理生化功能,并幫助細胞修復損傷,最終減少細胞的死亡。
　　因此本研究從心肌收縮功能,SR功能,氧化應(yīng)激狀態(tài),蛋白氧化修飾,細胞鈣瞬變功能以及心肌代謝狀況等幾個方面分兩部分作了研究。
　　方法
　　1.使用大

3、鼠心臟,將心臟主動脈與心臟灌流裝置(Langendorff)相連接,進行逆向灌流。同時記錄冠脈血流量,左室收縮壓(LVSP)以及左心室形成壓(LVDP),同時在整個灌流過程中使用Acknowledge software(Biopac System Inc, USA)不斷計算左室內(nèi)壓力的變化率最大值(±dp/dtmax)。采用Global缺血30min再灌注30min的I/R模型。
　　2.心肌梗死面積采用TTC染色法測定。

4、　　3.使用多種方法測量心臟氧化應(yīng)激狀態(tài)。測量心臟組織中丙二醛(MDA,一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物)的含量。心臟谷胱甘肽(GSH)含量的檢測。GSH是谷胱甘肽過氧化酶清除ROS所必需的。測定細胞內(nèi)氧化還原態(tài)的變化(i.e.NADH/NAD+)。
　　4.心肌肌漿網(wǎng)SR囊泡分離。心臟左室組織被粉碎并混勻兩次,每次20s。勻漿緩沖劑(mmol/L)包含10NaHCO3,5 NaN3,15 Tris-HCl(pH6.8),以及蛋白酶抑制劑(1μ

5、mol/L leupeptin,1μmol/L pepstatin以及100μmol/L phenylmethyl-sulfonylfluoride)。將混合物以9500rpm離心20min,取上清進一步離心19000rpm45min。離心后的沉淀物用緩沖液(0.6 mol/L KCl和20 mmol/L Tris-HCl pH6.8)重懸,以19000rpm45min離心,離心后的沉淀物重懸于0.25 mol/L sucrose和10

6、 mmol/L histidine(pH7.0)的混合液中。以上實驗步驟在0°C至4°C的環(huán)境中進行操作。
　　5.肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA)攝取鈣的測量。
　　6.肌漿網(wǎng)鈣釋放通道蛋白(RyR)活性的測量。使用測量(3H)-ryanodine親和力的方法測量。
　　7.分離成年大鼠心肌細胞。
　　8.建立細胞模擬心臟缺血再灌注模型。
　　9.測量細胞收縮和鈣瞬變。使用fluo-3負載熒光染色心肌細胞。

7、>　　10.測量細胞內(nèi)ROS的生成。心肌細胞在室溫下負載(DCFH-DA,10μmol/L)1小時。一旦進入細胞,DCFH-DA乙酸鹽組在酯酶的作用下裂解產(chǎn)生極性,非熒光產(chǎn)物DCFH積聚在細胞內(nèi)。活性氧產(chǎn)生氧化熒光產(chǎn)物二氯熒光素(DCF)。負載后,細胞在含有1.25 mmol/L鈣的改良Joklik MEM液中清洗3次,輕輕重懸然后沉淀去除細胞外DCFH-DA。新鮮分離的心肌細胞置于含介質(zhì)的定制腔室,它被放置在尼康倒落射熒光顯微鏡上并與

8、國際光子技術(shù)光電倍增管和Deltascan雙波長激發(fā)熒光分光光度計相連接。在單一的桿狀細胞內(nèi)用Felix軟件以1 point/second記錄DCF熒光(激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為530nm)并用×200放大倍數(shù)觀測。
　　11.免疫沉淀法測量SERCA和RyR的氧化修飾狀態(tài)。
　　12.心臟灌流[1-13C]葡萄糖或2.5mM[3-13C]丙酮酸鹽。
　　13. NMR測量13C光譜和H光譜。
　　結(jié)果<

9、br>　　1.100 nmol/L和1μmol/LApelin-13組LDH釋放量明顯減少。
　　2.各組心肌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的心梗。
　　3. Apelin改善了再灌注后的心臟收縮功能,降低了缺血過程中的左室舒張壓,減輕了缺血攣縮的發(fā)生和發(fā)展。
　　4. Apelin改善了心肌內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。
　　5. Apelin增強了SERCA攝取鈣的能力改善了RyR釋放鈣的能力。
　　6. Apelin減弱了SERC

10、A和RyR的氧化修飾。
　　7. Apelin減少了單細胞ROS的生成。
　　8. Apelin改善了單細胞鈣瞬變功能和收縮功能。
　　9.使用PI3K,PKC,PKCε,mitoKATP channel的抑制劑或阻斷劑可以抵消或部分抵消Apelin的保護作用。
　　10. Apelin增加了心臟缺血時的糖酵解。
　　11.Apelin增加了心臟缺血時的ATP含量。
　　12. Apelin增加了丙氨

11、酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。
　　13. Apelin延遲了心肌缺血攣縮的發(fā)生時間。
　　結(jié)論
　　Apelin-13能夠保護缺血再灌注損傷的心肌收縮功能,其機制可能是:一方面Apelin抑制心肌產(chǎn)生過多的ROS從而減少SR鈣處理蛋白的氧化修飾,維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),減輕鈣超載的同時又保證收縮功能需要的鈣。其作用依賴于 PI3K-PKCs(PKCε)-mitoKATP channel通路。另一方面Apelin能夠增加缺血時糖酵解的作用