阿爾茨海默病患者presenilin-1基因突變篩查及其起始密碼子突變后表達的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種進行性不可逆神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年癡呆最常見的病因。至今AD的確切病因和發(fā)病機制不明，目前已知載脂蛋白Eε4等位基因與遲發(fā)性AD相關(guān)，早發(fā)性家族性AD主要由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloidprecursorprotein，βAPP)、早老素-1(presenilin-1，PS-1)及早老素-2(presenilin-2，PS-2)基因突變引

2、起。目前對于PS-1基因突變?nèi)绾沃虏∵€不清楚，之前的研究認為突變的PS-1通過“獲得功能”(gainoffunction)影響β-淀粉樣多肽1-42(Amyloidβ1-42，Aβ42)而發(fā)病，即淀粉樣蛋白級聯(lián)假說(AmyloidCascadeHypothesis)，該假說認為異常的β淀粉樣蛋白(amyloid-βpeptides，Aβ)是觸發(fā)病理級聯(lián)反應并最終導致AD的第一步。Aβ是由正常存在于細胞膜上的APP經(jīng)β-和γ-分泌酶剪切后

3、產(chǎn)生一系列長度在39～43個氨基酸的短肽，其中，Aβ42最容易聚集纖維化，是主要的致病蛋白。早老素(presenilin，PS)蛋白是γ-分泌酶復合物的活性亞基，如發(fā)生突變，可影響APP剪切而導致異常Aβ的產(chǎn)生和聚集。近期的研究發(fā)現(xiàn)，某些PS-1基因突變不通過Aβ42致病。因此，需要更多的研究參與闡述PS-1基因突變與AD的關(guān)系。
　　 目的：
　　 通過篩查突變頻率最高的PS-1基因突變來觀察111例來自浙江大學醫(yī)學院

4、附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者并且未經(jīng)家族史和發(fā)病年齡篩選的情況下PS-1基因的突變情況。篩查發(fā)現(xiàn)1例患者PS-1基因3號外顯子起始密碼子發(fā)生了雜合突變ATG→GTG，構(gòu)建突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞觀察PS-1起始密碼子突變后PS-1和APP的表達變化情況。
　　 方法：
　　 研究對象共266例包括未經(jīng)過家族史和發(fā)病年齡篩選的111例來自浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者，5例M7

5、66患者親屬，150例正常對照。常規(guī)酚/氯仿提取法提取外周血DNA，對PS-1基因13個外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子DNA擴增，聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)產(chǎn)物純化后直接測序分析。利用體外定點突變技術(shù)突變野生型PS-1cDNA并構(gòu)建野生型和突變型PS-1增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)融合基因質(zhì)粒，通過實時熒光定量PCR檢測PS-1和APP基因

6、在人胚胎腎(HEK)293細胞、小鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a中的mRNA表達情況，并通過Westernblot技術(shù)觀察野生型和突變型PS-1蛋白在兩個細胞系中的表達變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)發(fā)現(xiàn)患者M766的PS-1基因3號外顯子起始密碼子發(fā)生了雜合突變ATG→GTG。該患者的發(fā)病年齡為57歲。其93歲母親、63歲的大妹妹和患者的小兒子也檢測到同樣的突變，但均未發(fā)病。同時，發(fā)現(xiàn)3個已報道的單核苷酸多態(tài)(Single

7、NucleotidePolymorphisms，SNP)(rs1800839，rs116882898，rs165932)。
　　 (2)實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PS-1基因mRNA在HEK293細胞和N2a細胞中野生型均顯著高于突變型，APP基因mRNA在兩細胞系中未見明顯差異。
　　 (3)Westernblot結(jié)果顯示野生型和突變型PS-1在HEK293細胞中均表達，且突變型表達量較野生型少。而N2a細胞僅表達野生

8、型PS-1。
　　 結(jié)論：
　　 (1)對未經(jīng)過家族史和發(fā)病年齡篩選的111例來自浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者行PS-1基因突變篩查未發(fā)現(xiàn)新的或已經(jīng)報道的致病突變，提示PS-1基因突變導致的AD占總AD患者比例較低。
　　 (2)根據(jù)M766患者家系圖顯示，未見PS-1基因起始密碼子突變和疾病AD共分離現(xiàn)象，推測其可能不是致病突變，而是AD的一個危險因素，也可能是一個SNP。

9、r>　　 (3)實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PS-1基因mRNA在HEK293細胞和N2a細胞中野生型均顯著高于突變型，Westernblot技術(shù)檢測PS-1蛋白表達顯示野生型和突變型PS-1在HEK293細胞中均表達，且突變型表達量較野生型少。而N2a細胞僅表達野生型PS-1，提示PS-1基因非ATG起始密碼子GTG在HEK293細胞中表達效率降低，而在神經(jīng)樣細胞N2a中可能引起PS-1蛋白不表達。
　　 (4)實時熒光定量P