miR-26a在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、機(jī)體骨或血管再生或愈合的過程受到一系列生長因子的調(diào)控,這些生長因子從愈合初期開始,直到整個愈合過程都對加速骨組織再生與愈合過程起到了重要的調(diào)節(jié)作用。通過聯(lián)合多個生長因子的蛋白或相應(yīng)的基因的方案在可以一定程度上促進(jìn)骨或血管組織的再生。但是,這種外源性的干預(yù)手段可能會打破骨重建過程中骨形成與骨吸收之間或血管重建過程中血管新生與血管改建之間的平衡從而導(dǎo)致過量新生骨生長至缺損以外的區(qū)域或大量不成熟的血管形成而造成血管高壓進(jìn)一步發(fā)生血管微滲漏。并

2、且,至今仍未找到理想的手段能夠在體內(nèi)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)以可控的方式同時將多個生長因子聯(lián)合遞送。病毒轉(zhuǎn)染一直以來都面臨著生物安全性的問題,被認(rèn)為其存在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或機(jī)體產(chǎn)生免疫排斥的風(fēng)險。因此,通過外源性的干預(yù)手段促進(jìn)組織再生的臨床應(yīng)用前景仍不樂觀。
　　骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為威脅人類健康的一大疾病,在全世界范圍內(nèi),大約有二分之一的女性或者四分之一的男性患有骨質(zhì)疏松。目前,臨床上針對骨質(zhì)疏松治療的藥物有很多種,其中大部分是抑制骨吸收的藥物,即通

3、過抑制骨吸收的速度和數(shù)量而發(fā)揮藥效。但針對刺激骨形成而逆轉(zhuǎn)骨形成與骨吸收之間被打破的平衡從而恢復(fù)骨總量的藥物卻相對較少。其中,甲狀旁腺激素(PTH)是唯一一個美國藥品與食品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)(FDA)的通過增加骨形成量治療骨質(zhì)疏松的藥物。但其給藥方式需嚴(yán)格遵守間隔給藥并且堅(jiān)持用藥持續(xù)長達(dá)兩年時間。由于PTH直接作用于破骨細(xì)胞,若長時間連續(xù)給藥會導(dǎo)致骨吸收進(jìn)一步增強(qiáng)而加重骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展,而若給藥時間過短則無法達(dá)到藥效。因此,有必要在新的領(lǐng)域

4、發(fā)現(xiàn)能夠有效逆轉(zhuǎn)骨形成與骨吸收之間這一平衡的安全有效的藥物。
　　miRNA是由約22個核苷酸組成內(nèi)源性的非編碼、對蛋白分子的表達(dá)具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNAs,廣泛存在于動物和植物真核生物的細(xì)胞內(nèi)。自1993年,第一個miRNA(lin-4)被發(fā)現(xiàn)后,近二十年來,miRNA領(lǐng)域研究發(fā)生了顯著的進(jìn)步。已經(jīng)有成百上千的miRNA被研究者鑒定出。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)顯示,每個miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因,這也表明miRNAs調(diào)節(jié)了多種生

5、物學(xué)信號通路甚至可能影響所有的信號途徑。越來越多的研究證明,microRNA對成骨與成血管相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號分子具有重要的調(diào)節(jié)作用,與各種信號通路一起,構(gòu)成了干細(xì)胞成骨-成血管分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由于一個miRNA可以調(diào)控數(shù)以萬計的靶基因,因此,一個miRNA便可以通過與多條成骨-成血管相關(guān)的信號通路作用從而同時調(diào)控多種促進(jìn)骨與血管生長因子的表達(dá),使組織工程骨移植后及時形成成熟穩(wěn)定的血管并最終理想的修復(fù)骨缺損成為可能
　　研究發(fā)現(xiàn),

6、這些miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等機(jī)體的各項(xiàng)基本生理功能,參與了各種各樣的生物學(xué)過程。通過對基因組上miRNA的位點(diǎn)分析,發(fā)現(xiàn)其在生物體的發(fā)育以及各種疾病中也參與了非常重要的調(diào)節(jié)作用。因此,對miRNA的表達(dá)進(jìn)行干涉后,便有可能對相關(guān)疾病起相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　miRNA的作用特點(diǎn)是:在不同種屬的表達(dá)具有高度保守性、幾個miRNA聚集在一起呈簇分布、表達(dá)呈組織特異性、穩(wěn)定性高、表達(dá)具有時間和空間的特異性,因此其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用

7、越來越受到大家的關(guān)注。但若將miRNA作為治療的手段應(yīng)用于組織再生的領(lǐng)域,仍面臨著諸多的困難如轉(zhuǎn)染效率低,靶向差,在體內(nèi)易降解而難以達(dá)到藥效等。
　　針對以上問題,我們首先通過文獻(xiàn)資料,生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫等方法分析比較成骨-成血管發(fā)育或再生過程中的miRNA表達(dá)譜。通過real time RT-PCR篩選驗(yàn)證出能夠同時促進(jìn)內(nèi)源性的成骨-成血管相關(guān)多個關(guān)鍵的生長因子的表達(dá)的miRNA(miR26a),通過正常條件下在骨缺損區(qū)周圍上調(diào)m

8、iR-26a的表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)理想的骨缺損修復(fù)的效果。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該miR-26a對骨質(zhì)疏松疾病也有一定的調(diào)節(jié)作用,通過將骨質(zhì)疏松條件下的間充質(zhì)干細(xì)胞中(OVX-MSC)miR-26a過表達(dá),分別在體內(nèi)和體外環(huán)境中逆轉(zhuǎn)了骨質(zhì)疏松條件間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的缺陷。最后,為了實(shí)現(xiàn)對miRNA體內(nèi)局部長效緩慢釋放,我們自主合成了miRNA局部緩釋體系,在無細(xì)胞參與的條件下通過靶向調(diào)節(jié)多個成骨-成血管分化相關(guān)的關(guān)鍵性的生長因子的表達(dá)并維持其高水平表達(dá)持

9、續(xù)較為長久的時間,從而極其理想的促進(jìn)骨再生。以上研究成果為將miRNA做為治療手段應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域提供了有力的依據(jù)。
　　研究結(jié)果:
　　1 miR-26a在體外可以在BMMSC細(xì)胞中有效地從基因與蛋白兩個水平同時促進(jìn)多個成骨-成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達(dá)與分泌,并在體內(nèi)異位再生環(huán)境中能夠有效的促進(jìn) BMMSCs向成骨與成血管方向的分化,進(jìn)而促進(jìn)骨-血管的再生。進(jìn)一步,在正常小鼠的顱骨極限缺損模型上,通過將其缺損區(qū)植入及其周

10、圍細(xì)胞的miR-26a過表達(dá),發(fā)現(xiàn)其能同時促進(jìn)缺損區(qū)及周圍機(jī)體自身細(xì)胞中多個成骨-成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達(dá)與分泌,最終以內(nèi)源性的調(diào)節(jié)手段實(shí)現(xiàn)最理想的骨缺損修復(fù)的效果;2通過real time RT-PCR的方法觀察到miR-26a的表達(dá)與骨質(zhì)疏松疾病呈正相關(guān)。在OVX-MSC過表達(dá)miR-26a后,有效地促進(jìn)了其Alp、Ocn的表達(dá)進(jìn)而體外逆轉(zhuǎn)了OVX-MSC堿性磷酸酶的活性與礦化能力,體內(nèi)逆轉(zhuǎn)了 OVX-MSC異位骨再生的能力并最終

11、有效促進(jìn)了OVX-MSC修復(fù)骨缺損的能力;
　　3.基于聚醚,聚酯材料,利用聚合和點(diǎn)擊化學(xué)方法,我們合成出生物可降解的效率高,毒性小、轉(zhuǎn)染效率高的生物可降解miRNA轉(zhuǎn)染體系。為了在體內(nèi)環(huán)境中完整的保持 miRNA生物學(xué)活性并實(shí)現(xiàn)其緩慢釋放持續(xù)一個長久的時間以達(dá)到長效的治療效果,我們將miRNA/聚合物復(fù)合體包裹于PLGA微球中,發(fā)現(xiàn)其能功能性的作用于目標(biāo)基因并維持長效的調(diào)節(jié)作用,并進(jìn)一步將PLGA微球附著于PLLA納米多孔支架上

12、,以使其能夠靶向高效作用于骨缺損區(qū)域。結(jié)果證明,我們構(gòu)建miR-26a局部緩釋體系能夠?qū)崿F(xiàn)理想的骨修復(fù)效果;
　　結(jié)論
　　1體外環(huán)境中,在BMMSC中上調(diào)miR-26a的表達(dá)可以從基因與蛋白兩個水平同時促進(jìn)多個成骨-成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達(dá)與分泌;在體內(nèi)環(huán)境中,通過將缺損區(qū)及其周圍細(xì)胞的miR-26a過表達(dá),能夠?qū)崿F(xiàn)理想的骨缺損修復(fù)的效果;
　　2在OVX-MSC過上調(diào)miR-26a后,能夠在體外環(huán)境中有效的逆轉(zhuǎn)O

13、VX-MSC堿性磷酸酶的活性與礦化能力,體內(nèi)環(huán)境中逆轉(zhuǎn)了 OVX-MSC異位骨再生的能力并最終有效促進(jìn)了OVX-MSC修復(fù)骨缺損的能力;
　　3我們通過將自主合成的miRNA轉(zhuǎn)染體系與miRNA結(jié)合后包裹于PLGA微球中并進(jìn)一步將PLGA微球附著于PLLA納米多孔支架上構(gòu)建的miRNA體內(nèi)局部緩釋體系,克服了將miRNA應(yīng)用于治療領(lǐng)域所面臨的轉(zhuǎn)染效率低,靶向差,在體內(nèi)易降解而難以達(dá)到藥效的困難,在無細(xì)胞參與情況下,實(shí)現(xiàn)了理想的骨缺