基于BMMNCs的骨再生策略在骨缺損修復(fù)中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的:
　　骨缺損的修復(fù)是臨床治療的巨大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的自體骨移植因來源有限和供區(qū)損傷等問題具有很大的局限性。組織工程骨的發(fā)展為骨缺損治療開辟了嶄新的途徑。然而，體外培養(yǎng)組織工程骨過程復(fù)雜且成本高昂，已經(jīng)開展的臨床試驗(yàn)數(shù)量很少，因此，組織工程骨尚不能常規(guī)進(jìn)入臨床使用。由于骨髓血中富含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，新鮮采集的骨髓血常被用于輔助骨缺損的修復(fù)，通過將骨髓血中的骨髓單個(gè)

2、核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)濃縮富集，可提高干細(xì)胞的濃度。近年來，已經(jīng)有許多直接運(yùn)用濃縮骨髓進(jìn)行骨缺損修復(fù)的臨床報(bào)道，并且開始逐漸推廣。這種方法與經(jīng)典的組織工程骨相比，二者修復(fù)效果有何差別尚無相關(guān)報(bào)道，特別是缺乏詳細(xì)的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。為此，在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建節(jié)段性骨缺損模型，以β-磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)為支架，比較運(yùn)用BMMNCs和經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的

3、BMSCs修復(fù)骨缺損的差異，并進(jìn)行了長達(dá)一年的觀察。用多種先進(jìn)的技術(shù)手段對兩種方法形成的再生骨組織進(jìn)行了形態(tài)、化學(xué)構(gòu)成及生物力學(xué)的研究和比較，并找到了再生骨組織與自體正常骨組織之間的差異。此外，首次使用BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂骨缺損，并通過三維CT與傳統(tǒng)的自體骨移植進(jìn)行了為期一年的隨訪比較，為BMMNCs進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下了重要的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.制備BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TC

4、P兩種移植物:從比格犬髂后上嵴抽取骨髓血15ml，以Ficoll密度梯度離心法制備BMMNCs，將其體積濃縮為500μl，然后接種至加工好的圓柱形β-TCP支架上。用瑞氏-姬姆薩染色觀察處理前后骨髓血成分的變化，同時(shí)以犬細(xì)胞因子芯片測量BMMNCs中常見細(xì)胞因子的含量，并與外周血、未濃縮骨髓血作比較。同樣方法抽取15ml骨髓血，從中分離培養(yǎng)BMSCs，擴(kuò)增至P1代時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為20×106/ml，體積500μl，接種至相同支架上，換

5、用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14天。以CM-Dil染料染色后在共聚焦顯微鏡下觀察兩種移植物細(xì)胞分布情況。
　　2.比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù):建立比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損模型，應(yīng)用制備好的BMMNCs/β-TCP移植物、BMSCs/β-TCP移植物進(jìn)行修復(fù)，以單純?chǔ)?TCP支架和空白處理作為對照。術(shù)后2周，3月，6月，12月分別行X線觀察，術(shù)后12月行SPECT-CT檢查，12月取材后通過大體觀察，Micro-CT，硬組織切片組織學(xué)

6、檢查評(píng)價(jià)修復(fù)效果。
　　3.再生骨組織的微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成與生物力學(xué)分析:以BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP兩種典型的方法修復(fù)比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損，術(shù)后12月取材，同時(shí)取對側(cè)自體骨為對照，樣本包埋并打磨后，以雙光子和二次諧波顯微顯像的方法檢測骨組織的膠原和血管等細(xì)微結(jié)構(gòu)，以激光拉曼光譜檢測骨組織化學(xué)成分，以納米壓痕儀檢測骨組織微觀力學(xué)性能。
　　4.BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂:首先定量分析齒槽

7、裂缺損的體積，采用三維打印和計(jì)算機(jī)輔助法計(jì)算骨缺損區(qū)域體積，以明確所需移植物量;然后分別以BMMNCs復(fù)合β-TCP和自體髂骨移植物進(jìn)行骨缺損修復(fù)。術(shù)后3月，6月，12月進(jìn)行三維CT影像學(xué)分析，評(píng)估缺損修復(fù)情況和移植物變化。
　　結(jié)果:
　　1.從比格犬15ml骨髓血中平均獲取BMMNCs濃度為33.0±8.8×106/ml，濃縮后可見其成分主要為有核細(xì)胞，而紅細(xì)胞含量大幅下降，細(xì)胞在β-TCP支架上均勻散在分布，鏡下呈圓形

8、。細(xì)胞因子分析顯示，IL-8在BMMNCs中明顯高于外周血和未濃縮的骨髓血，而BMMNCs和骨髓血中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation end products，RAGE)和干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)的濃度則較外周血低。15ml骨髓血經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得BMSCs細(xì)胞濃度為20×106/ml，體外成骨誘導(dǎo)成功，細(xì)胞在支架上交織成網(wǎng)狀緊密黏附。
　　2.

9、比格犬脛骨節(jié)段性缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，BMMNCs組表現(xiàn)出更好的修復(fù)效果，該組80％的動(dòng)物均在術(shù)后3月即形成了明顯的骨連接，取出內(nèi)固定后無再骨折發(fā)生;術(shù)后12月可見骨痂改建，骨皮質(zhì)密度增加，髓腔形成，移植物與自體骨組織銜接良好，無明顯分界。在BMSCs組中，術(shù)后3月與6月截骨線仍明顯，無法及時(shí)拆除內(nèi)固定，移植物與自體脛骨分界清晰，大量支架未能降解，支架周圍骨質(zhì)菲薄，但支架內(nèi)部可見較多的骨組織形成。單純支架組的移植物術(shù)后6月幾乎完全吸收。SPE

10、CT-CT示BMMNCs組移植物區(qū)域較BMSCs組有更明顯的放射性濃聚，表明其代謝活躍。Micro-CT分析BMMNCs組平均骨組織體積為1231.38mm3，骨組織占比65.14％。BMSCs組平均骨組織體積為755.65mm3，骨組織占比41.29％，二者差異具有顯著性。
　　3.雙光子和二次諧波信號(hào)顯示BMMNCs組樣本的膠原纖維貼附于孔壁，呈層狀排列，或在孔中央呈同心圓樣排列形成類哈弗斯管結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞位于膠原層之間，血管位

11、于膠原中央或貼附于材料孔壁上。在BMSCs組樣本中，可見膠原纖維呈束狀由孔壁或聯(lián)通孔處發(fā)散，密度較BMMNCs組低，同心圓結(jié)構(gòu)不明顯。拉曼光譜檢測顯示BMMNCs組樣本、BMSCs組樣本和自體脛骨組織的峰位相似，但強(qiáng)度不同。BMNNCs組的礦物/基質(zhì)比顯著高于BMSCs組;碳酸/磷酸比在自體骨組織中較再生骨組織低;膠原交聯(lián)比在BMMNCs組樣本中較自體骨低，但在BMSCs組則與自體骨無顯著差異;碳酸/氨基酸Ⅰ比值在BMMNCs組中顯著升

12、高，可見該組樣本中存在很活躍的骨改建活動(dòng)。納米壓痕結(jié)果顯示BMMNCs組樣本的壓痕模量為15.61Gpa，硬度為0.67Gpa，與自體骨組織相似，并顯著高于BMSCs組。
　　4.術(shù)前齒槽裂患者的骨缺損體積在3D打印模型上計(jì)算所得平均值為1.52ml，略高于通過計(jì)算機(jī)輔助工程(computer aided engineering，CAE)軟件計(jì)算的體積(1.47ml)，二者無顯著差異，兩種方法均適用于齒槽裂的術(shù)前評(píng)估。在齒槽裂修復(fù)

13、研究中，所有的患者術(shù)區(qū)均愈合良好，沒有嚴(yán)重并發(fā)癥出現(xiàn)。BMMNCs組多數(shù)患者(8/10)的齒槽裂得到了較好的修復(fù)，形成了骨連接。術(shù)后3月，BMMNCs組移植物的平均體積為7245±220.5mm3。術(shù)后六月，移植物體積降低至6122±211.5mm3。術(shù)后12月平均BV與術(shù)后六月相似，為5890±180.5mm3。自體髂骨組與BMMNCs組相似，術(shù)后6月移植物平均體積為678.7±2110mm3與BMMNCs組相似，術(shù)后12月移植物平均

14、體積與6月時(shí)相似，為635.3±1975mm3。兩種方法相比無顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.在比格犬脛骨節(jié)段性缺損的修復(fù)中，采用直接濃縮制備的BMMNCs結(jié)合β-TCP材料比采用經(jīng)體外培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)后的BMSCs效果更好。
　　2.與BMSCs相比，BMMNCs結(jié)合β-TCP策略形成的骨組織更加豐富，其化學(xué)成分、生物力學(xué)性質(zhì)也與自體骨組織更加接近。
　　3.在齒槽裂修復(fù)中，缺損體積在術(shù)前通過3D打印模型和CAE