對(duì)Nrf1D亞細(xì)胞定位及降解過(guò)程的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景:
  近年來(lái),Nrf2作為細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化應(yīng)激分子開(kāi)關(guān)已引起人們的廣泛關(guān)注,然而,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)其同源性分子Nrf1有著Nrf2不可彌補(bǔ)的作用,因而,越來(lái)越多的研究者將注意力從Nrf2轉(zhuǎn)移至Nrf1。多年研究發(fā)現(xiàn),Nrf1在轉(zhuǎn)錄后會(huì)產(chǎn)生多種剪接突變體。而Nrf1D就是其中之一,與全長(zhǎng)Nrf1相比,Nrf1D不再包含功能性翻譯終止子(2267-2270bp),而且還導(dǎo)致亮氨酸拉鏈序列的后半部分也發(fā)生改變。其N端66

2、9個(gè)氨基酸與Nrf1完全一致,而在這669個(gè)氨基酸之后,原來(lái)Nrf1靠近C端72個(gè)氨基酸被另外80個(gè)氨基酸取代。并且研究得知,這80個(gè)氨基酸對(duì)Nrf1D起負(fù)調(diào)控作用。這80個(gè)氨基酸中還包含一個(gè)42個(gè)氨基酸的分支,該分支與另一種bZIP蛋白(fra2)在亮氨酸拉鏈的相同的位置有明顯同源性。雖然,Nrf1D已經(jīng)被證明確實(shí)是存在的,但對(duì)其蛋白表達(dá)方面尚未進(jìn)行探究。既然活細(xì)胞成像技術(shù)可以應(yīng)用于膜蛋白降解過(guò)程的動(dòng)態(tài)研究,那么,Nrf1表達(dá)蛋白作為

3、一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,其全長(zhǎng)以及各種突變亞型也可以用此技術(shù)做相應(yīng)研究。
  研究目的:
  運(yùn)用RT-PCR分析Nrf1D存在的組織,再用藥物預(yù)處理后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)和Westernblotting技術(shù)檢測(cè)這幾種藥物對(duì)Nrf1D蛋白表達(dá)量的影響,最后再結(jié)合活細(xì)胞成像分析Nrf1多種突變亞型降解的動(dòng)態(tài)變化。
  研究方法:
 ?、俜崔D(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)定位Nrf1D;②雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)和Western

4、blotting技術(shù)檢測(cè)這幾種藥物(DTT(0,0.5mM,1mM)、維生素C(0,100μM,200μM)以及tBHQ(0,25μM,50μM)處理24h,TPA(0,100nM,200nM)處理4h)對(duì)Nrf1D表達(dá)量的影響;③活細(xì)胞成像分析Nrf1多種亞型的動(dòng)態(tài)變化。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  ①RT-PCR分析得出:Nrf1D存在于骨髓中。
  ②通過(guò)活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nrf1D比Nrf1降解的慢。
  當(dāng)相同

5、質(zhì)量的Nrf1、Nrf1D以及Nrf1Δ670-741與ER-DsRed共轉(zhuǎn)COS-1細(xì)胞時(shí),首先可以觀察到三種蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。在用Digitonin(20μg/ml)處理細(xì)胞10min時(shí),只有Nrf1有較明顯的降解,而Nrf1D以及Nrf1Δ670-741幾乎無(wú)降解。然后再加入ProtinaseK(50μg/ml),三者均處理30min發(fā)現(xiàn):Nrf1會(huì)完全降解,而Nrf1D和Nrf1Δ670-741依然大量未被降解。
  

6、③雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)和Westernblotting技術(shù)檢測(cè)出:(1)DTT、維生素C以及tBHQ對(duì)Nrf1D的活性起到正調(diào)控作用;(2)TPA發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能;(3)上述藥物對(duì)其表達(dá)量的影響均存在一定的劑量依賴性;(4)這些藥物主要是影響糖基化的蛋白亞型。
 ?、芑罴?xì)胞成像技術(shù)研究得出的多種Nrf1亞型動(dòng)態(tài)降解的快慢是不同的。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
 ?、傧鄬?duì)于Nrf1C端的72個(gè)氨基酸而言,Nrf1DC端的80個(gè)氨基酸對(duì)其活性

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