硫化氫參與新生期結(jié)腸炎性刺激誘發(fā)成年大鼠內(nèi)臟痛的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　?。?）研究CBS調(diào)控電壓門控型鈉通道在新生期結(jié)腸炎性刺激誘導(dǎo)的慢性內(nèi)臟痛中的作用；
　　（2）研究去甲腎上腺素（NE）通過CBS調(diào)控辣椒素受體（TRPV1）在新生期結(jié)腸炎性刺激誘導(dǎo)的慢性內(nèi)臟痛中的作用；
　　方法：
　　1.對出生十天的新生期雄性大鼠在肛門處插入2cm注射0.2ml的0.5%的冰醋酸(AA)造成新生期結(jié)腸炎性刺激(NCI)從而誘導(dǎo)成年大鼠的結(jié)腸慢性痛過敏模型。運(yùn)用腹壁撤回評分（AWR

2、score）方法評測NCI大鼠的痛行為反應(yīng)。
　　2.結(jié)腸管壁注射熒光素（DiI）來標(biāo)記結(jié)腸特異性背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗方法研究NCI大鼠中腸相關(guān)DRG神經(jīng)元電壓依賴型鈉通道的變化特性。
　　3.運(yùn)用ELISA試劑盒檢測NCI模型大鼠血清中去甲腎上腺素（NE）的水平。
　　4.運(yùn)用Western Blotting方法檢測NCI模型大鼠腸相關(guān)DRG神經(jīng)元中CBS,鈉通道蛋白和TRPV1受體蛋白表達(dá)情況。

3、
　　結(jié)果：
　　1.NCI明顯增加大鼠對結(jié)腸擴(kuò)張的過敏反應(yīng)，六周時(shí)，AWR評分顯著高于對照組，這種痛覺反應(yīng)持續(xù)至少三周。在第十周和第十二周時(shí)，AWR評分恢復(fù)到正常水平。
　　2.NCI增加腸相關(guān)DRG神經(jīng)元（T13-L2）電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達(dá)水平。而十周齡時(shí)NCI組和對照組的腸相關(guān)DRG神經(jīng)元電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達(dá)水平均沒有顯著差異

4、。同樣地，我們檢測了六周齡NCI組和對照組的非腸相關(guān)神經(jīng)元(L4-5)DRG，發(fā)現(xiàn)電壓門控型鈉通道的電流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達(dá)水平均沒有顯著差異免疫組化三標(biāo)技術(shù)顯示在DRG腸特異性神經(jīng)元中CBS和NaV1.7或NaV1.8共表達(dá)。
　　3.與對照組相比，NCI組CBS的表達(dá)水平顯著上調(diào)。CBS的拮抗劑AOAA翻轉(zhuǎn)NCI引起的大鼠內(nèi)臟痛覺反應(yīng)，最優(yōu)劑量10mg/kg的藥效持續(xù)至少一個(gè)小時(shí)。并且，AOAA翻轉(zhuǎn)NCI

5、引起的腸相關(guān)DRG神經(jīng)元鈉電流密度的增加和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表達(dá)水平的增加。
　　4.在最佳劑量下，非選擇性β腎上腺素受體拮抗劑，而不是α腎上腺素受體拮抗劑，明顯翻轉(zhuǎn)由HIS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸痛過敏。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，阻斷β2腎上腺素受體明顯降低由應(yīng)激導(dǎo)致的AWR高評分，而β1和β3腎上腺素受體拮抗劑對這種高評分沒有明顯作用。
　　5.NE參與內(nèi)臟痛敏感的形成。與對照組相比，ELISA結(jié)果顯示，NCI大鼠血清NE激素

6、水平顯著上調(diào)。但是，β2受體蛋白表達(dá)水平與對照組相比沒有明顯變化。而且，去甲腎上腺素能誘導(dǎo)大鼠內(nèi)臟痛過敏反應(yīng)。
　　6.TRPV1表達(dá)水平上調(diào)是由NE介導(dǎo)的。NCI大鼠腸相關(guān)DRG神經(jīng)（T13-L2）中，TRPV1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。給予正常大鼠NE，腸相關(guān)DRG神經(jīng)元（T13-L2）中 TRPV1的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。給予 NCI組大鼠非選擇性腎上腺素受體β拮抗劑，顯著降低TRPV1蛋白表達(dá)水平。用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，NE孵育正常大

7、鼠的DRG細(xì)胞，CBS表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　7.CBS參與NCI-TRPV1痛覺信號通路的傳遞。給予正常大鼠NE，腸相關(guān)DRG神經(jīng)元（T13-L2）中CBS的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。給予NCI組大鼠非選擇性腎上腺素受體β拮抗劑，顯著降低CBS蛋白表達(dá)水平。給予NCI組大鼠CBS拮抗劑AOAA，顯著降低TRPV1蛋白表達(dá)水平。
　　8.用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，NE孵育正常大鼠的DRG細(xì)胞，CBS和TRPV1表達(dá)水平顯著上調(diào)。