硫化氫參與新生期結(jié)腸炎誘發(fā)成年大鼠慢性內(nèi)臟痛的脊髓機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：腸易激綜合癥（irritable bowel syndrome，IBS）臨床表現(xiàn)為腹部疼痛不適，是一種常見的胃腸道疾病。至今，IBS的發(fā)病機(jī)理還尚未明確。已有研究結(jié)果顯示硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）在內(nèi)臟痛覺過敏的形成過程中發(fā)揮著重要作用。然而，內(nèi)臟痛敏過程中H2S在脊髓中的作用還不清楚。本課題旨在探究H2S在新生期結(jié)腸炎癥（neonatal colonic inflammation，NCI）模型鼠脊髓中如何

2、參與內(nèi)臟痛敏的形成。
　　方法：⑴NCI模型的建立：挑選出生后10天Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，將2cm導(dǎo)管插入大鼠肛門，并向其腸道內(nèi)注射0.2 ml的0.5％冰醋酸（AA）從而誘導(dǎo)成年大鼠慢性內(nèi)臟痛過敏模型。⑵腹部撤回反射評(píng)分（abdominal wall reconstruction，AWR score）：待大鼠6周齡時(shí)，通過結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal distention，CRD）的方法比較對(duì)照組（C

3、ON）、NCI大鼠及注射藥物后大鼠的痛行為。⑶蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）：提取6周大鼠的胸腰椎段與T13-L2背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）相連接的脊髓背角，對(duì)其進(jìn)行蛋白定量分析，檢測(cè) NCI模型大鼠脊髓背角內(nèi)源性 H2S的合成酶胱硫醚β合成酶（cystathionineβ-synthetase，CBS）的表達(dá)。⑷脊髓切片膜片鉗技術(shù)：記錄 CON、NCI以及給藥處理后的脊髓膠狀質(zhì)（subs

4、tantia gelatinosa，SG）的突觸傳遞及其神經(jīng)元的興奮性。
　　結(jié)果：①新生大鼠腸道注射0.5%冰醋酸，成年后測(cè)量其對(duì)CRD的反應(yīng)，結(jié)果顯示NCI模型大鼠的AWR評(píng)分顯著高于CON組，提示大鼠產(chǎn)生內(nèi)臟痛覺高敏。②NCI大鼠脊髓背角SG區(qū)神經(jīng)元興奮性增加。表現(xiàn)在其發(fā)放動(dòng)作電位（action potential，AP）的頻率在40 pA、80 pA和120 pA電流刺激下顯著增加，動(dòng)作電位閾值（AP threshold）

5、超極化和基強(qiáng)度（rheobase）顯著降低，而靜息膜電位（resting membrane potential）沒有變化。③NCI大鼠可增強(qiáng)SG自發(fā)的興奮性突觸傳遞。利用脊髓切片膜片鉗技術(shù)測(cè)定SG中自發(fā)興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory post-synaptic currents，sEPSCs）的變化，結(jié)果顯示NCI大鼠SG中sEPSC的頻率顯著升高，但幅度沒有明顯變化。④用Western Blot方法檢測(cè)

6、6周大鼠T13-L2段脊髓背角CBS的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與CON組相比NCI可顯著上調(diào)CBS的表達(dá)。與行為結(jié)果相一致：NCI大鼠6周時(shí)，其AWR評(píng)分高于CON組，表現(xiàn)為大鼠內(nèi)臟痛覺高敏。CSE表達(dá)則無明顯改變。⑤給正常大鼠脊髓切片孵育NaHS（2.5μM）可增強(qiáng)sEPSC的頻率，其幅度沒有明顯變化。⑥正常大鼠脊髓切片孵育TTX（1.0μM）后再灌流NaHS（2.5μM）記錄微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory post

7、-synaptic currents，mEPSCs）。結(jié)果顯示孵育NaHS后mEPSC頻率顯著升高，幅度沒有明顯差異。提示NaHS通過突觸前機(jī)制發(fā)揮作用。⑦連續(xù)7天給予正常大鼠鞘內(nèi)注射NaHS（2.5μM）后，可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生內(nèi)臟高敏。模擬NCI大鼠脊髓背角CBS上調(diào)引起的內(nèi)臟痛敏。⑧連續(xù)7天給予NCI模型大鼠鞘內(nèi)注射AOAA（10μg/kg）后，可顯著降低NCI大鼠的內(nèi)臟高敏反應(yīng)，提示CBS-H2S參與NCI大鼠的內(nèi)臟痛敏。⑨連續(xù)7天給

8、予NCI模型大鼠鞘內(nèi)注射AOAA（10μg/kg）后，可減弱NCI大鼠脊髓背角SG神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞，提示CBS-H2S可在脊髓背角水平發(fā)揮作用參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟痛。
　　結(jié)論：新生期結(jié)腸炎導(dǎo)致成年大鼠脊髓背角神經(jīng)元興奮性增加和突觸傳遞增強(qiáng)，脊髓背角 CBS表達(dá)的上調(diào)可能參與了突觸傳遞增強(qiáng)和成年 NCI大鼠的內(nèi)臟高敏；CBS-H2S信號(hào)系統(tǒng)可能主要通過突觸前機(jī)制增加脊髓背角 SG中細(xì)胞的興奮性突觸傳遞及SG神經(jīng)元的興奮性。本研究揭示