折疊式人工玻璃體填充聚乙烯醇水凝膠重建自然玻璃體的實驗研究.pdf

1、背景:
　　 玻璃體是一種透明的不可再生的凝膠體，其主要由99％的水與1％的無機(jī)鹽、膠原和透明質(zhì)酸等構(gòu)成，膠原纖維呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其上附著透明質(zhì)酸粘多糖，后者能與水分子結(jié)合，從而使玻璃體呈凝膠狀。玻璃體的主要生理功能是支撐視網(wǎng)膜、眼屈光、細(xì)胞屏障和營養(yǎng)等。由于自然玻璃體的不可再生性，因此，當(dāng)發(fā)生玻璃體視網(wǎng)膜疾病時，如:外傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜脫離、外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(T-PVR)、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、增生性糖尿病

2、視網(wǎng)膜病變(PDR)、嚴(yán)重眼內(nèi)炎等等，需行玻璃體切割手術(shù)治療，術(shù)中切除自然玻璃體后必須填充合適的人工玻璃體替代物，修復(fù)眼損傷，支撐視網(wǎng)膜，重建視功能，防止眼球萎縮。
　　 目前，研究者們對玻璃體替代物的研究甚多，臨床常用的主要有空氣、惰性氣體、重水、硅油、重硅油等。使用的方式均為直接注入至玻璃體腔，與視網(wǎng)膜直接接觸，利用其表面張力而達(dá)到支撐視網(wǎng)膜的效果。以上除硅油外，均為短期應(yīng)用。然而，長期的硅油填充，容易導(dǎo)致一系列的術(shù)后并發(fā)癥

3、，如并發(fā)性白內(nèi)障、繼發(fā)性青光眼、角膜變性、硅油乳化、甚至可移行至視網(wǎng)膜下和視神經(jīng)，造成視神經(jīng)纖維的髓鞘脫失，導(dǎo)致視力永久喪失。因此，頗為亟待尋找一種具有良好生物相容性，無嚴(yán)重并發(fā)癥，并能長期填充的人工玻璃體。
　　 水凝膠因具有良好的生物相容性、光學(xué)性能、減震性，能模擬自然玻璃體的特性，而被譽(yù)為是人工玻璃體最好的候選者，從上世紀(jì)九十年代以來一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。主要有聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]水

4、凝膠、聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]水凝膠、聚丙烯酸[poly(acrylic acid)，PAA]水凝膠和聚丙烯酰胺[polyacrylamide，PAM]水凝膠等。研究者們可體外通過改變水凝膠的合成過程，來滿足自然玻璃體的物理性能，然后將其注入體內(nèi)。也可以將液態(tài)的高分子物質(zhì)注射入玻璃體腔后進(jìn)行原位交聯(lián)而形成水凝膠，這就可避免注射過程中對水凝膠結(jié)構(gòu)的破壞。同時，水凝膠還可以負(fù)載藥物，作為眼內(nèi)藥物釋放的載

5、體。作為短期的玻璃體替代物，水凝膠在動物實驗眼中應(yīng)用并沒有明顯的術(shù)后并發(fā)癥。但由于其注入玻璃體腔后，與視網(wǎng)膜直接接觸，使得水凝膠參與眼內(nèi)代謝和循環(huán)，導(dǎo)致在眼內(nèi)容易被降解和吸收。因此，仍然不能作為長期的玻璃體替代物，不能滿足對治療嚴(yán)重的視網(wǎng)膜脫離等疾病需要長期頂壓的要求。所以，如何減少或阻止水凝膠在眼內(nèi)的降解吸收，延長水凝膠在玻璃體腔的停留時間，使之能成為一種長期填充的人工玻璃體是眼科研究一個非常重要的科學(xué)問題。
　　 自然玻璃體

6、有一層薄膜包圍，此薄膜屬于解剖學(xué)玻璃體皮質(zhì)范疇。由于年齡、外傷和視網(wǎng)膜玻璃體病變等因素，薄膜結(jié)構(gòu)可遭到破壞，受此啟發(fā)，我們研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)目前人工玻璃體的研究方法是直接注射，都沒有解決人工玻璃體和眼內(nèi)組織直接接觸導(dǎo)致的各種問題。需要研究一個能像自然玻璃體一樣的囊膜包繞人工玻璃體，限制人工玻璃體的眼內(nèi)流動，避免或減少被吸收和變質(zhì)，從而延長人工玻璃體的使用時間。
　　 因此，我們首次提出一個替代自然玻璃體的新策略-折疊式人工玻璃體(FC

7、VB)，它主要由球囊、引流管和引流閥組成。球囊部是通過計算機(jī)精細(xì)模擬人眼玻璃體制作而成，并且通過引流管與引流閥相連接，由能在體內(nèi)應(yīng)用20年以上的硅橡膠薄膜制成。通過微創(chuàng)切口將球囊部植入到玻璃體腔，隨后注入流動介質(zhì)，如生理鹽水、硅油、水凝膠等，形成玻璃體形狀的薄膜球囊支撐視網(wǎng)膜、充填眼球。
　　 折疊式人工玻璃體避免了目前人工玻璃體的嚴(yán)重缺點(diǎn)，可以精細(xì)模擬自然玻璃體的結(jié)構(gòu)，恢復(fù)自然玻璃體的視網(wǎng)膜支撐、眼屈光、細(xì)胞屏障等主要生理功能

8、。并通過從動物實驗、標(biāo)準(zhǔn)制定到臨床試驗的系列研究證實，折疊式人工玻璃體填充硅油在眼內(nèi)長期填充后顯示出良好的生物相容性，有效的360°全方位支撐視網(wǎng)膜，促進(jìn)脫離視網(wǎng)膜的復(fù)位，能顯著減少硅油誘導(dǎo)的并發(fā)癥如硅油乳化、繼發(fā)性青光眼、角膜變性等。但是，由于折疊式人工玻璃體填充硅油后無法恢復(fù)自然玻璃體的屈光性能，沒有恢復(fù)自然玻璃體所擁有的機(jī)械減震和粘彈性能。
　　 目的:
　　 因此，結(jié)合水凝膠的國際研究進(jìn)展，本課題提出應(yīng)用折疊式人

9、工玻璃體填充聚乙烯醇(PVA)水凝膠重建自然玻璃體的設(shè)想。利用輻照法交聯(lián)得到不同濃度的PVA水凝膠，體外檢測光學(xué)、物理、機(jī)械性能及細(xì)胞毒性等，篩選最接近于人自然玻璃體性能的PVA水凝膠;在兔眼模型中全面評估FCVB填充PVA水凝膠作為玻璃體替代物的光學(xué)物理性能、視網(wǎng)膜支撐功能和生物相容性等。本研究旨在探討FCVB填充PVA水凝膠作為玻璃體替代物，具有良好的生物相容性，能夠避免PVA水凝膠與視網(wǎng)膜的直接接觸，阻止PVA水凝膠參與眼內(nèi)代謝和

10、循環(huán)，減少PVA水凝膠的降解和吸收，延長水凝膠在玻璃體腔內(nèi)的停留時間，恢復(fù)自然玻璃體的屈光、視網(wǎng)膜支撐和粘彈性能，從而達(dá)到重建自然玻璃體的目的。
　　 材料和方法:
　　 第一部分:聚乙烯醇(PVA)水凝膠的制備及其性能與生物相容性研究
　　 1.PVA水凝膠的制備:聚乙烯醇(PVA)購于Sigma Aldrich公司。配制不同濃度（1％、3％、7％，質(zhì)量-體積分?jǐn)?shù)）PVA溶液，采用γ-射線(Co60)輻照交聯(lián)得

11、到1％PVA水凝膠、3％PVA水凝膠、7％PVA水凝膠。將水凝膠分別浸入雙蒸水中浸泡48h，以除去未交聯(lián)PVA單體。
　　 2.物理與光學(xué)性能:測量充分溶脹后的PVA水凝膠的比重、含水率、透光率、屈光率、pH值、溶脹性能等參數(shù)。
　　 3.流變性能:PVA水凝膠經(jīng)充分溶脹后，應(yīng)用ARES-RFS流變儀對水凝膠行動態(tài)應(yīng)變掃描測試、粘彈性能和蠕變性能測試。測量溫度為37±0.1℃。動態(tài)應(yīng)變掃描測試:在振蕩頻率1Hz條件下，確

12、定線性粘彈區(qū)間的應(yīng)變振幅后;在該應(yīng)變振幅下，檢測水凝膠在振蕩頻率范圍為0.01-10Hz時儲存模量(G′)和損耗模量(G″)的動態(tài)變化。蠕變測試，在恒定剪切應(yīng)力σ0=0.1Pa條件下，檢測水凝膠隨著剪切應(yīng)力時間的延長(500s)，其應(yīng)變（力反應(yīng)的變化趨勢。用同樣方法測量硅油和透明質(zhì)酸酸鈉的流變性能。通過對比選取其中一種與自然玻璃體參數(shù)最為相似的PVA水凝膠。
　　 4.體外細(xì)胞毒性試驗:采用噻唑藍(lán)比色法（MTT法）測定PVA水凝

13、膠對L929鼠成纖維細(xì)胞生長抑制作用。制備待測樣本浸泡液:樣本分為6組(1％PVA、3％PVA、7％PVA、FCVB+1％PVA、FCVB+3％PVA、FCVB+7％PVA),分別將樣本放入DMEM培養(yǎng)基浸泡24h、48h、72h，收集浸泡液備用。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100μL細(xì)胞懸液（每孔5000個細(xì)胞）細(xì)胞貼壁后，加入不同樣本的浸泡液，以培養(yǎng)液作為對照。將培養(yǎng)板置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24h、

14、48h、72h。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和行MTT比色檢測，酶標(biāo)儀于波長570nm下測定OD值并計算抑制率，評價樣品的細(xì)胞毒性。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示。MTT比色試驗中，不同時間點(diǎn)及不同組OD值用單個重復(fù)測量因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
　　 第二部分:折疊式人工玻璃體(FCVB)填充PVA水凝膠重建自然玻璃體的體內(nèi)研

15、究
　　 1.動物手術(shù):選取體重2.5-3kg新西蘭白兔18只，所有實驗操作嚴(yán)格遵守ARVO關(guān)于實驗動物使用的規(guī)定。分為三組:PVA水凝膠組（PVA組）、FCVB+PVA水凝膠組（FCVB+PVA組）、平衡鹽液組（BSS組）。右眼行常規(guī)三通道玻璃體切割術(shù)，切除玻璃體，術(shù)中填充PVA水凝膠6眼、填充FCVB+PVA水凝膠6眼、填充BSS溶液6眼。術(shù)后常規(guī)予典必殊滴眼液、普南撲靈滴眼液和百力特滴眼液滴術(shù)眼抗炎預(yù)防感染治療。
　

16、　 2.術(shù)后觀察:術(shù)后3、7、14、30、60、90、180天，常規(guī)行裂隙燈、直接眼底鏡、眼壓和眼底照相檢查，觀察術(shù)眼前節(jié)和眼底情況;術(shù)后14、30、60、90和180天行術(shù)眼B超檢查了解玻璃體腔和眼底視網(wǎng)膜解剖位置情況:術(shù)后90、180天，分別行雙眼ERG檢查，評估玻璃體替代物植入后對視網(wǎng)膜功能的影響。
　　 3.眼球病理檢測:于術(shù)后90天（PVA組，3只;FCVB+PVA組，3只;BSS組，3只）和180天（PVA組，3只

17、;FCVB+PVA組，3只;BSS組，3只），用過量利多卡因麻醉處死兔子，剜出眼球，馬上取出并收集眼內(nèi)PVA水凝膠后，迅速將眼球迅速放入固定液中，固定眼球，按常規(guī)方法做石蠟切片光學(xué)顯微鏡、HE染色檢查。
　　 4.PVA水凝膠性能檢測:將眼內(nèi)填充后的PVA水凝膠分別行透光率、屈光率和流變學(xué)檢查。方法同前。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示。眼壓用單

18、個重復(fù)測量因素方差分析，ERG振幅值用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時采用S-N-K法進(jìn)行多重比較，方差不齊時采用近似F檢驗Welch法進(jìn)行校正，采用Dunnett T3法進(jìn)行多重比較。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:聚乙烯醇(PVA)水凝膠的制備及其性能與生物相容性研究
　　 1.光學(xué)及物理性能:1％PVA水凝膠的含水率為98.9％，屈光指數(shù)為1.335

19、5，透光率為94.8％，pH值為7.22，比重為1.0039;3％PVA水凝膠的含水率為98.1％，屈光指數(shù)為1.3361，透光率為93.2％，pH值為7.25，比重為1.0144;7％PVA水凝膠的含水率為93.5％，屈光指數(shù)為1.3425，透光率為88％，pH值為7.41，比重為1.1147;自然玻璃體的含水率為98-99％，屈光指數(shù)為1.3345-1.3348，透光率為＞90％，pH值為7.0-7.4，比重為1.0053-1.00

20、89。
　　 2.流變性能:三種濃度PVA水凝膠儲存模量(G′)均大于損耗模量(G″)，表明三種物質(zhì)均為有粘彈性能的凝膠體，且其彈性性能大于粘性性能。而硅油表現(xiàn)為損耗模量(G″)大于儲存模量(G′)，提示其粘性性能大于彈性性能，因此主要表現(xiàn)為粘性液體的狀態(tài)。1％PVA:G′為3.2±1.1 Pa，G″為0.8±0.5 Pa;3％PVA:G′為6.1±1.3 Pa，G″為1.3±0.9 Pa;7％PVA:G′為106.5圭18.6

21、 Pa，G″為18.3±12.8Pa;硅油:G′為2.4±1.6 Pa，G″為44.8±28.3 Pa;透明質(zhì)酸:G′為155.2±147.2 Pa，G″為92.9±49.1 Pa。自然玻璃體:G，為2.8±0.9 Pa，G″為0.7±0.4 Pa
　　 在順應(yīng)性方面，良好的順應(yīng)性使得在玻璃體腔內(nèi)可以擁有更為良好的機(jī)械性能，7％ PVA＞3％ PVA＞1％ PVA;在蠕變方面，它代表的是迅時彈性形變的能力和柔韌性，3％ PVA＞

22、7％ PVA＞1％ PVA。綜合以上光學(xué)、物理和流變性能，可以得出3％PVA水凝膠的性能更為接近自然玻璃體，因此選擇3％PVA水凝膠作為FCVB填充物進(jìn)行體內(nèi)的進(jìn)一步研究。
　　 3.細(xì)胞毒性:6組（1％PVA、3％PVA、7％PVA、FCVB+1％PVA、FCVB+3％PVA、FCVB+7％PVA）材料樣品浸泡提取液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24、48及72h后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)均無顯著變化。MTT比色法測定OD值，提示在2

23、4、48、72h三個時間點(diǎn)，1％PVA、3％PVA、7％PVA組及FCVB+1％PVA、FCVB+3％PVA、FCVB+7％PVA組與對照組，OD值比較均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。所以，結(jié)果提示FCVB填充PVA水凝膠后或單純PVA水凝膠均無明顯細(xì)胞毒性。
　　 第二部分:折疊式人工玻璃體(FCVB)填充PVA水凝膠重建自然玻璃體的體內(nèi)研究
　　 1.裂隙燈:術(shù)后3天，PVA組及BSS組均出現(xiàn)了不同程度結(jié)膜水腫、

24、充血和輕度前房炎癥反應(yīng)，至術(shù)后7天癥狀全部消失;而FCVB+PVA組在術(shù)后7天前房仍出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞，但未見瞳孔后粘連及纖維素樣滲出，給予積極抗炎防感染治療后，到術(shù)后14天結(jié)膜水腫、充血及前房炎癥逐漸消退。在隨后長達(dá)半年的隨訪觀察，三組白兔術(shù)眼的眼前節(jié)均為出現(xiàn)明顯異常，但是PVA組和BSS組有術(shù)眼出現(xiàn)不同程度的晶體混濁，術(shù)后90天時白內(nèi)障發(fā)生率:PVA組為16.7％(1/6);術(shù)后180天時白內(nèi)障發(fā)生率:PVA組為33.3％(1/3)，

25、BSS組為16.7％(1/6);由于先前研究發(fā)現(xiàn)兔眼植入FCVB后白內(nèi)障的發(fā)生率較高，考慮本研究觀察時間較長，白內(nèi)障嚴(yán)重后會影響玻璃體腔和眼底視網(wǎng)膜等組織的觀察，為避免二次手術(shù)，本研究中FCVB+PVA組采取行玻璃體切割手術(shù)的同時行晶體切除術(shù)。
　　 2.眼底檢查:術(shù)后14天，F(xiàn)CVB+PVA組隨著炎癥不斷消退，眼底可隱約見視盤和血管，至術(shù)后30天，眼底能清晰可見，直至觀察終點(diǎn)術(shù)后180天，玻璃體腔仍然保持透明，能清晰看到眼底視

26、網(wǎng)膜、血管、視盤等結(jié)構(gòu)。在PVA組，術(shù)后14天時能清晰看到眼底，然而隨著白內(nèi)障的發(fā)展和進(jìn)一步加重，術(shù)后90天和180天，眼底逐漸變得模糊，但是仍可見眼底視盤、血管、視網(wǎng)膜等大體結(jié)構(gòu)。BSS組在180天的觀察期內(nèi)，眼底均可清晰可見。隨訪觀察期內(nèi)三組術(shù)眼均未見有玻璃體出血、混濁、玻璃體視網(wǎng)膜增殖和視網(wǎng)膜脫離等情況發(fā)生。
　　 3.眼壓:術(shù)后第3天，F(xiàn)CVB+PVA組眼壓呈現(xiàn)下降趨勢，與術(shù)前比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，但到術(shù)

27、后7天，眼壓逐漸上升至正常范圍，與術(shù)前比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，至術(shù)后14天、30天、60天、90天、180天，眼壓一直維持在正常范圍，與術(shù)前比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。在PVA組和BSS組，術(shù)后3天眼壓出現(xiàn)明顯的升高，與術(shù)前相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，但到術(shù)后7天，眼壓逐漸降低至正常范圍，與術(shù)前比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，至術(shù)后14天、30天、60天、90天，眼壓維持較平穩(wěn)，與術(shù)前比較無顯著統(tǒng)

28、計學(xué)差異(P＞0.05)。但是在術(shù)后180天，PVA組眼壓與術(shù)前相比呈顯著下降趨勢(P＜0.05)。
　　 4.眼部B超:在術(shù)后整個180天的隨訪觀察期內(nèi)，三組兔眼眼部B超均未顯示有玻璃體混濁、玻璃體腔出血、增殖或視網(wǎng)膜脫離、脈絡(luò)膜脫離等聲像。FCVB+PVA組眼底B超提示FCVB囊壁與視網(wǎng)膜相貼，良好的支撐視網(wǎng)膜。
　　 5.眼部電生理:全視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢查提示:FCVB+PVA組，術(shù)后90天和術(shù)后180天，a波

29、和b波峰值均比術(shù)前下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在PVA組和BSS組，術(shù)后90和180天a波和b波峰值與術(shù)前變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6.眼球病理:FCVB+PVA組，術(shù)后90、180天剜出眼球，大體解剖觀察可見眼球充實飽滿，F(xiàn)CVB填充PVA水凝膠后能良好的支撐視網(wǎng)膜，取出FCVB球囊內(nèi)的PVA水凝膠仍然透明和維持較好的粘彈性。PVA組，術(shù)后90天摘出眼球飽滿充實，取出眼內(nèi)PVA水凝膠亦保持

30、透明和一定的粘彈性;但是在術(shù)后180天時，摘出的眼球外觀輕度萎縮，取出眼內(nèi)PVA水凝膠雖然透明，但是明顯被降解和吸收，間中混有較多的水樣物質(zhì)，粘彈性明顯減弱。取出眼球固定后，石蠟固定切片，HE染色，提示:除FCVB+PVA組在術(shù)后180天視網(wǎng)膜出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)纖維層變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等情況外，其余均未見明顯結(jié)構(gòu)異常包括角膜、睫狀體、視網(wǎng)膜等。
　　 7.光學(xué)性能與流變學(xué)檢查:術(shù)后90天，F(xiàn)CVB+PVA組與PVA組填充后

31、的PVA水凝膠其光學(xué)和流變性能和填充前相比無顯著改變。在FCVB+PVA組，PVA水凝膠填充180天后，其光學(xué)與流變性能和填充前相比仍然無明顯改變，PVA水凝膠無明顯降解和吸收。然而在PVA組，PVA水凝膠填充180天后，其折光率和流變性能較前發(fā)生明顯改變，折光率降低為1.3121，儲存模量(G′)從6.1±1.3降至3.9±0.8 Pa，損耗模量(G″)從1.3±0.9降至0.8±0.5 Pa，粘彈性能明顯降低，提示經(jīng)180天眼內(nèi)填充

32、后PVA水凝膠顯著被降解和吸收。
　　 結(jié)論:
　　 1.3％PVA水凝膠具有與自然玻璃體相似的光學(xué)、物理和流變性能，擁有良好的生物相容性，能很好的模擬自然玻璃體的性能。
　　 2.FCVB填充3％PVA水凝膠作為一個新的玻璃體替代物，經(jīng)兔眼玻璃體腔內(nèi)的長期（180天）填充后，發(fā)現(xiàn)其具有良好的光學(xué)性能、機(jī)械性能和生物相容性，能夠安全有效、全方位的支撐視網(wǎng)膜，維持視網(wǎng)膜的解剖結(jié)構(gòu);FCVB能有效的發(fā)揮生物屏障的功能