果膠-聚乙烯醇復(fù)合水凝膠人工髓核假體的基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景： 80％的人在一生中曾有過下腰痛困擾，而椎間盤退行性病變是下腰痛常見的病因。對于有癥狀的椎間盤退變性疾病原則上采用“階梯療法”進(jìn)行治療，隨著椎間盤退變的加劇，治療階梯隨之上升，治療費用和副作用相應(yīng)增加，故宜在椎間盤退變的早期對其進(jìn)行椎間關(guān)節(jié)成形(SpineArthroplasty)，以期保留和重建脊柱運(yùn)動單元(Functionalsegmentunit，F(xiàn)SU)的生理功能。髓核置換是采用人工髓核假體重建前柱、早期治療椎

2、間盤退變性疾的一種椎間關(guān)節(jié)成形技術(shù)，具有恢復(fù)椎間高度、保留運(yùn)動等功能，成為脊柱外科研究熱點之一。 研究目的： 1、探索CoPP水凝膠的制備方法，并表征其微觀結(jié)構(gòu)，評價其溶脹性能。 2、評價溶脹平衡CoPP水凝膠縱向加載時的靜態(tài)生物力學(xué)性能。 3、評價CoPP水凝膠的體外急性細(xì)胞毒性及植入動物體內(nèi)后的局部炎癥反應(yīng)，完成CoPP水凝膠的基本生物相容性評價。 4、探索腰椎間盤MRI圖像重建髓核三維模型的

3、方法，并完成國人CoPP人工髓核假體三維形狀、尺寸的優(yōu)化設(shè)計。 研究方法： 1、選定適宜質(zhì)量比例的XPV-MC300果膠、PVA-124聚乙烯醇及蒸餾水，經(jīng)過溶脹、低頻振蕩加熱、凍融，制備成圓柱狀PVA水凝膠試件12個、CoPP水凝膠試件24個，隨機(jī)分為兩組，分別觀察凍干(FreezeDrying，F(xiàn)D)及無水乙醇(AbsoluteEthanol，AE)脫水對PVA、CoPP水凝膠質(zhì)量脫水率(DRM)、體積脫水率(DRV

4、)的影響。 2、將溶脹平衡的圓柱狀CoPP、PVA水凝膠試件各4個，在MTS-858MiniBionix材料試驗機(jī)上縱向預(yù)加載5次，加載速率5N/s，回零后加載至600N，持續(xù)30min后快速卸載，實時記錄力、位移、時間；并測量加載前、卸載后24小時內(nèi)的質(zhì)量、尺寸。計算以下指標(biāo)： ①將第6次應(yīng)力、應(yīng)變行線性擬合，所得一次項系數(shù)即為彈性模量； ②將第5次加載-卸載數(shù)據(jù)，利用Origin7.5軟件按照橫坐標(biāo)為0～55

5、％、縱坐標(biāo)為0～2.0MPa(長度比1.25)制出應(yīng)力-應(yīng)變曲線，以統(tǒng)一格式導(dǎo)出圖像，用Metlab7.0軟件計算滯后環(huán)面積及上升曲線與橫坐標(biāo)間的面積，兩者的比值即為能量吸收率； ③外力達(dá)到600N時應(yīng)變?yōu)镾c，持續(xù)加載30min，每隔5min的應(yīng)變與Sc相比，即為歸一化蠕變量； ④卸載后的質(zhì)量、體積占加載前試件原始質(zhì)量、體積的百分比，即為歸一化質(zhì)量與體積百分比。采用獨立樣本t檢驗，比較CoPP、PVA水凝膠兩者的彈性模

6、量、能量吸收率；采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，比較加載前、卸載后即刻、24小時之間的歸一化質(zhì)量及體積百分比；采用獨立樣本t檢驗比較PVA與CoPP水凝膠之間歸一化質(zhì)量及體積百分比的差異。 3、選用NCTCL929小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外急性細(xì)胞毒性試驗，分為正常組、陰性對照組(PVA/FD、PVA/AE)、實驗組(CoPP/FD、CoPP/AE)、陽性對照組(0.64％苯酚)，定期施加每組的干預(yù)因素，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，于培養(yǎng)2、4、

7、7d測定OD值、計算相對增殖率(RGR)。 4、在接受GESignaExcite3.0磁共振儀常規(guī)檢查腰部MRI的患者中，除外創(chuàng)傷、炎癥、畸形及前中柱腫瘤等疾患，選取無陽性體征、年齡居于20～50歲、T2加權(quán)掃描中椎間盤退變不超過Pfirrmann2級與Modic分型不超過1級的患者。 結(jié)果： 1、聚乙烯醇(25％)、果膠(5％)的水溶液，經(jīng)過溶脹、低頻振蕩加熱、凍融，成功制備出圓柱狀CoPP水凝膠試件。凍干脫水

8、破壞水凝膠的外形，而無水乙醇脫水不破壞水凝膠外形，但是凍干的脫水率顯著大于無水乙醇的脫水率。25％PVA水凝膠的質(zhì)量脫水率、體積脫水率，顯著大于同種脫水方法下的CoPP水凝膠。CoPP水凝膠的FTIR譜圖、XRD圖是PVA和果膠兩者的疊加；CoPP水凝膠的DSC曲線中有兩個熔融峰，分別在182.6℃和225.1℃處，后者與PVA粉末的結(jié)晶熔融峰對應(yīng)；經(jīng)凍干、無水乙醇脫水CoPP水凝膠的斷面，在掃描電鏡下均可見孔隙形成，孔徑在10μm～5

9、0μm之間，其內(nèi)含有顆粒；而同樣條件下的PVA水凝膠斷面，未發(fā)現(xiàn)明顯的孔隙形成。CoPP水凝膠的擴(kuò)散特征指數(shù)(n)接近0.5，CoPP水凝膠的溶脹速率常數(shù)(k)、以及溶脹平衡時的質(zhì)量溶脹率(197.38％～252.49％)、體積溶脹率(241.47％～308.93％)，均顯著大于PVA水凝膠。 2、在縱向加載-卸載試驗過程中，CoPP水凝膠、PVA水凝膠試件均未出現(xiàn)破壞，其應(yīng)力-應(yīng)變曲線可分為相對平緩的起始段、相對陡峭的上升段，

10、呈非線性表現(xiàn)。CoPP水凝膠全段應(yīng)力-應(yīng)變曲線擬合后的彈性模量為(2.76±0.09)MPa，與成形髓核假體適宜的3MPa接近；顯著小于PVA水凝膠的(4.89±0.61)MPa。在加載-卸載的應(yīng)力-應(yīng)變曲線中，CoPP、PVA水凝膠均出現(xiàn)應(yīng)變滯后于應(yīng)力現(xiàn)象，形成滯后環(huán)，其對應(yīng)的能量吸收率，CoPP水凝膠為12.50％±1.47％，PVA水凝膠為8.57％±1.78％，兩者差異顯著。持續(xù)加載30min，CoPP、PVA水凝膠均達(dá)到蠕變平

11、衡，其歸一化蠕變量分別為1.076±0.005、1.105±0.030。卸載后即刻，CoPP水凝膠歸一化質(zhì)量百分比為(97.67±0.98)％，顯著小于PVA水凝膠的(99.15±0.18)％。卸載后24小時，CoPP、PVA水凝膠歸一化質(zhì)量百分比、體積百分比，與加載前無差異。 3、陰性對照組(PVA/FD、PVA/AE)、實驗組(CoPP/FD、CoPP/AE)中的L929細(xì)胞，呈長梭形，與正常對照組同時貼壁，圓形細(xì)胞均小于1

12、0％，胞漿內(nèi)可見離散顆粒，極個別細(xì)胞出現(xiàn)溶解，隨著培養(yǎng)時間的延長，均出現(xiàn)接觸性生長抑制。陽性對照組中的L929細(xì)胞幾乎全部為圓形、體積減小，無貼壁，無明顯細(xì)胞增殖。CoPP組RGR均大于75％，PVA組RGR超過80％，細(xì)胞毒性小于1級；陽性對照組RGR小于24％、細(xì)胞毒性為4～5級。所有SD大鼠于術(shù)后2～6小時蘇醒、開始活動，無死亡，手術(shù)切口無紅腫、滲出、化膿等炎癥表現(xiàn)，均一期愈合。在植入1周時，PVA、CoPP水凝膠的體積較植入時明

13、顯增大、在肌袋內(nèi)可活動，肌肉色澤鮮紅、局部無膿性分泌物。病理切片顯示：PVA、CoPP組局部組織的炎性細(xì)胞反應(yīng)為IV級、未形成完整囊腔；CoPP水凝膠呈嗜堿性、染色較深，孔隙較多、孔徑大，PVA水凝膠近中性、染色淺，孔隙少、孔徑小。在植入4周時，PVA、CoPP水凝膠在肌袋內(nèi)基本無活動，局部組織結(jié)構(gòu)無異常，炎性細(xì)胞反應(yīng)為I級，囊腔反應(yīng)為IV級；PVA、CoPP水凝膠的染色、結(jié)構(gòu)無變化。在植入12周時，PVA、CoPP水凝膠的體積、外觀與

14、前2次取材時相似，炎性細(xì)胞及囊腔反應(yīng)均為I級；CoPP水凝膠斷面仍為嗜堿性深染，其邊緣連續(xù)、無明顯缺損；孔隙豐富，孔隙間的連接與第1周、4周相近，孔內(nèi)仍可見微小顆粒。 4、本實驗獲取的薄層MRI圖像，采自一名34歲女性，冠狀位脂肪抑制T2序列掃描(OCorfS，TE82.7ms，TR4000ms)，包括腰1～骶1椎間盤前、后緣，層厚1.2mm、層間距0mm的連續(xù)掃描，像素大小為0.625mm，獲得44張DICOM3.0格式的MR

15、I圖像。MRI圖像上椎間盤為Pfimnann1～2級；采用Mimics軟件分割圖像理想，重建的腰1～骶1髓核模型，其側(cè)視為橢圓，由扁平逐漸變成高聳穹隆狀，外形由鐵餅狀向橄欖球狀過渡。MRI圖像上髓核矢徑、橫徑與高度，自上而下呈逐漸增大趨勢，以橫徑為明顯；所有髓核的平均矢徑、橫徑與高度分別為(20.8±1.5)mm、(34.7±3.5)mm、(9.2±1.1)mm，與3D髓核模型的測量結(jié)果相近。CoPP水凝膠假體以完全脫水狀態(tài)植入，其體積

16、為人體髓核的25.90％～29.29％，其尺寸為人體髓核的63.74％～66.41％。本實驗設(shè)計出CoPP水凝膠人工髓核假體為近似橄欖球狀的橢圓球體，其側(cè)面為橢圓型，分小號(s)、中號(M1、M2)及大號(L)四種，其矢徑為13mm～14mm、橫徑為20mm～24mm，高度為5.5mm～7.0mm。 結(jié)論： 1、采用低頻振蕩、反復(fù)凍融可制備果膠/聚乙烯醇復(fù)合(CoPP)水凝膠，適宜采用無水乙醇脫水方法脫水。CoPP水凝膠

17、具有一定的結(jié)晶度，存在兩種結(jié)晶區(qū)，為多孔結(jié)構(gòu)。CoPP水凝膠具有良好的再水化特性，水分子是以菲克擴(kuò)散模式滲入，CoPP水凝膠具有溶脹程度大、溶脹速率快的特點，比單一材料的PVA水凝膠具有更好的溶脹性能。 2、CoPP水凝膠是一種粘彈性材料，相對于PVA水凝膠而言，具有軟而韌、緩沖載荷能力較強(qiáng)、蠕變特性等特點，其彈性模量與成形髓核假體適宜的模量接近；具有較好的滲透性，利于椎間隙內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，適宜于成形替代椎間盤髓核組織。 3