重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:脊髓損傷(Spinal cord injury)是目前公認(rèn)的疑難病之一,它具有高致殘率、高耗費(fèi)及患者主要為青壯年等特點(diǎn),對(duì)受害者是災(zāi)難性的事故。如何修復(fù)損傷脊髓及恢復(fù)損傷脊髓的功能目前仍沒(méi)有有效的對(duì)策,究其因?yàn)樵谟诔墒熘袠猩窠?jīng)再生困難,但近年來(lái)對(duì)脊髓損傷再生的一系列研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。許多新的方法如重復(fù)經(jīng)顱磁刺激,神經(jīng)移植包括神經(jīng)干細(xì)胞移植、胚胎脊髓移植、周圍神經(jīng)移植,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,電刺激等均可使成年動(dòng)物表現(xiàn)出某種程度的

2、恢復(fù)。其中重復(fù)經(jīng)顱磁刺激是一種無(wú)創(chuàng)無(wú)痛的新的治療方法。
　　 經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulate,TMS)是Barker等于1985年首先創(chuàng)立的一種皮層刺激方法,具有無(wú)痛、無(wú)損傷、操作簡(jiǎn)便、安全可靠等優(yōu)點(diǎn),很快得到臨床應(yīng)用。TMS是利用時(shí)變磁場(chǎng)作用于大腦皮層產(chǎn)生感應(yīng)電流改變皮層神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位,從而影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)的生物刺激技術(shù)。TMS的作用原理在于通過(guò)時(shí)變磁場(chǎng)誘發(fā)出感應(yīng)電場(chǎng),具

3、體為一個(gè)快速電流脈沖通過(guò)刺激線圈,產(chǎn)生強(qiáng)的瞬間磁場(chǎng),該磁場(chǎng)穿過(guò)顱骨,引起鄰近神經(jīng)組織產(chǎn)生繼發(fā)電流,局部神經(jīng)元發(fā)生去極化,從而產(chǎn)生生理效應(yīng)。
　　 經(jīng)顱磁刺激對(duì)于脊髓損傷的治療主要是改善脊髓損傷的運(yùn)動(dòng)功能,及各種并發(fā)癥的治療。其機(jī)制可能與經(jīng)顱磁刺激刺激大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì),使運(yùn)動(dòng)區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生去極化,增強(qiáng)皮質(zhì)脊髓束的傳導(dǎo)作用,促進(jìn)軸突的生長(zhǎng),從而改善運(yùn)動(dòng)功能。頻率是重復(fù)經(jīng)顱磁刺激的一個(gè)重要參數(shù),高頻或低頻對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的改善有無(wú)差異,

4、也需進(jìn)一步研究。
　　 目的:研究重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)急性脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法:利用重物撞擊法制作T10脊髓損傷模型。利用改良的脊髓打擊器,將40g重錘從30cm落下打擊第10胸椎節(jié)段脊髓損傷大鼠36只。脊髓損傷模型制作:大鼠先以3.6％水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉,俯臥位固定,背部剃毛備皮,常規(guī)消毒,定位于T10棘突位置,以此為中心做后背部正中切口,分離兩側(cè)椎旁肌肉,用血管鉗輕輕咬除T

5、10棘突和兩側(cè)椎板至關(guān)節(jié)突,充分暴露硬脊膜,將打擊器與脊髓接觸金屬頭輕輕接觸T10節(jié)段脊髓正中,使40g重錘放在撞擊器滑竿30cm處落下,大鼠出現(xiàn)一過(guò)性下肢抽動(dòng)、下身回縮、尾巴擺動(dòng)、雙下肢癱瘓,表明造模成功。逐層縫合椎旁肌肉和皮膚。術(shù)后保溫24h,每只大鼠皮下補(bǔ)液5ml,每天2次肌肉注射青霉素80000U,連續(xù)3天,防止泌尿感染,如果出現(xiàn)血尿繼續(xù)注射抗生素,直至血尿消失。每天早晚兩次人工按摩膀胱排尿,直至恢復(fù)反射性排尿?yàn)橹埂?br>　　

6、 48只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脊髓損傷對(duì)照組、高頻磁刺激組、低頻磁刺激組,每組12只。磁刺激組于手術(shù)后24h開(kāi)始給予刺激,高頻組頻率為10Hz,低頻組頻率為1Hz,均為閾上刺激,500個(gè)脈沖,每天1次,連續(xù)8周,脊髓損傷對(duì)照組給予假刺激。分別于術(shù)后1天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周進(jìn)行BBB(Basso Beatti and Bresnahan)行為學(xué)評(píng)分、檢測(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP),并于2周、4周時(shí)每組處死3

7、只大鼠,8周時(shí)處死全部大鼠,用HE染色觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化、并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)絲蛋白(NF-200)表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:1、大鼠行為學(xué)評(píng)分
　　 正常組為21分,穩(wěn)定無(wú)變化。經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析,結(jié)果顯示組間差異顯著(F=1618.988,P=0.000),治療組比不治療組其BBB評(píng)分要高。不同時(shí)間點(diǎn)差異有顯著性(F=624.690,P=0.000),各組BBB評(píng)分變化與時(shí)間變化有關(guān)。治療方法與時(shí)間之間有交

8、互作用(F=72.598,P=0.000),提示不同治療方法隨時(shí)間的增加,BBB評(píng)分變化趨勢(shì)不同。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng),結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組間比較均有顯著性差異(P均=0.000),各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較均有顯著性差異(P均=0.000)。正常組與其余3組在任何時(shí)間比均有顯著性差異(P均=0.000)。1天、1周時(shí)對(duì)照組、高頻組、低頻組間比較差異無(wú)顯著性(P均>0.05)。2周時(shí)對(duì)照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對(duì)照組與

9、低頻組比較差異有顯著性(P=0.034),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.021)。4周時(shí)對(duì)照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對(duì)照組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.000),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.024)。8周時(shí)對(duì)照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對(duì)照組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.026),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.013)。
　　 2、脊髓組織形態(tài)

10、r>　　 大體觀察:各組硬脊膜均完整,正常組脊髓完整光滑,脊髓損傷組損傷處可見(jiàn)脊髓表面黃染,脊髓明顯狹窄。
　　 400倍光鏡下觀察:正常組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見(jiàn)腫脹改變,神經(jīng)元形態(tài)正常,核圓,可見(jiàn)核仁；脊髓損傷對(duì)照組脊髓組織結(jié)構(gòu)疏松,可見(jiàn)空洞形成,神經(jīng)元大量壞死。脊髓損傷高頻組、低頻組可見(jiàn)脊髓組織較為疏松,膠質(zhì)細(xì)胞增生,部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹。
　　 3、免疫組化(NF-200陽(yáng)性纖維占總面積百分比％)
　　

11、正常組神經(jīng)纖維排列最密集,脊髓損傷對(duì)照組神經(jīng)纖維排列最稀疏,僅見(jiàn)很少且短的神經(jīng)纖維；脊髓損傷磁刺激組神經(jīng)纖維密集程度介于正常組與脊髓損傷對(duì)照組之間,高頻組較低頻組神經(jīng)纖維排列稍密集。
　　 NF-200陽(yáng)性纖維占總面積百分比經(jīng)析因方差分析顯示:不同時(shí)間點(diǎn)間比較(F=11.409,P=0.000)差異有顯著性,組間比較(F=172.941,P=0.000)差異有顯著性,時(shí)間和組間存在交互作用(F=4.736,P=0.001),提示

12、不同治療方法隨時(shí)間增加變化趨勢(shì)不同。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng),2周時(shí)組間比(F=151.415,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000差異有顯著性,高頻組與對(duì)照組比較P=0.222差異無(wú)顯著性,低頻組與對(duì)照組比較P=0.764.差異無(wú)顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.141差異無(wú)顯著性。4周時(shí)組間比(F=127.725,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000差異有顯著性,高頻組與對(duì)照組比

13、較P=0.003差異有顯著性,低頻組與對(duì)照組比較P=0.020差異有顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.194差異無(wú)顯著性；8周時(shí)組間比(F=65.211,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000,差異有顯著性,高頻組與對(duì)照組比較P=0.000差異有顯著性,低頻組與對(duì)照組比較P=0.000差異有顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.013差異有顯著性。表明4周時(shí)治療組NF-200較脊髓損傷對(duì)照組高,8周時(shí)高頻組較低頻

14、組NF-200表達(dá)增高。
　　 4、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位
　　 正常組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期最短,波幅最大；脊髓損傷對(duì)照組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期最長(zhǎng),波幅最小,幾乎不可見(jiàn)；脊髓損傷高頻組、低頻組潛伏期較正常組長(zhǎng),脊髓損傷對(duì)照組短,波幅較正常組明顯減小。
　　 對(duì)同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間的檢測(cè)出運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位陽(yáng)性率進(jìn)行比較除了正常組不變外(100％),其余各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001,0.001,和0.