光動力治療與VP3基因聯(lián)合治療鼻咽癌的療效研究.pdf

1、光動力治療(Photodynamic therapy，PDT)是采用一定波長的光照射蓄積于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的光敏劑，發(fā)生光物理化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生單態(tài)氧和自由基等其他活性物質(zhì)、破壞腫瘤微血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以殺傷腫瘤細(xì)胞的一種非手術(shù)治療方法。然而PDT是對氧的依賴性及治療深度的局限性限制其在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。近年來，隨著基因治療日益成為治療腫瘤的最有前景的手段之一，PDT與基因治療有機(jī)結(jié)合形成的PDT/基因治療可能是一種治療腫瘤的

2、嶄新策略。本文將分章討論自殺基因VP3對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用及體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PDT聯(lián)合自殺基因VP3治療鼻咽癌的療效。
　　第一章:自殺基因VP3對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響
　　目的:體外實(shí)驗(yàn)研究VP3基因其對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2生長、增殖、凋亡的影響，以求證實(shí)VP3對鼻咽癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　方法:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的PcDNA3.1(-)VP3-Myc(PVP3)及對照空載體質(zhì)粒PcD

3、NA3.1(-)轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測細(xì)胞生存率，RT-PCR、Western blot法檢測VP3表達(dá)效果，通過AnnexinⅤ檢測VP3對細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.VP3 mRNA在野生型及空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中均無明顯表達(dá)，在PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中有明顯表達(dá)，相對表達(dá)量約1.27±0.24。VP3蛋白(apoptin)在野生型及空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中均無明顯

4、表達(dá)，在PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中有明顯表達(dá)，相對表達(dá)量約0.22±0.06。
　　2.空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在24h、48h、72h細(xì)胞存活率分別為97.6±1.4％，94.2±1.7％、92.3±2.1％; PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在24h、48h、72h細(xì)胞存活率分別為79.7±3.6％，61.5±2.3％、52.4±3.8％。PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　3.空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在24h、

5、48h、72h細(xì)胞凋亡率分別為4.5±1.2％、5.1±0.8％、5.7±1.4％; PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在24h、48h、72h細(xì)胞凋亡率分別為11.6±2.4％、17.8±1.4％、27.3±3.3％。PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　結(jié)論:成功建立了VP3基因穩(wěn)定表達(dá)的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VP3能明顯抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長增殖，并能促進(jìn)CNE-2細(xì)胞的凋亡

6、，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了研究依據(jù)
　　第二章:光動力治療聯(lián)合VP3基因治療對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:擬對VP3聯(lián)合PDT對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，以證實(shí)VP3聯(lián)合PDT對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的殺傷效果。
　　方法:穩(wěn)定表達(dá)VP3基因的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2及對照組細(xì)胞分別接受不同能量密度的PDT治療，CCK-8法檢測細(xì)胞生存率，AnnexinⅤ法、Tunnel法檢測細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果

7、:
　　1.不同能量密度的PDT處理后，PVP3組細(xì)胞存活率明顯低于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在1、3、6.25 J/cm2能量密度下生存率分別為0.533±0.036、0.312±0.027、0.171±0.032;對照組細(xì)胞在1、3、6.25 J/cm2能量密度下生存率分別為0.816±0.058、0.570±0.044、0.308±0.047，兩組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　2.AnnexinⅤ

8、檢測顯示PVP3組細(xì)胞凋亡率明顯高于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在1、3、6.25 J/cm2能量密度下凋亡率分別為0.363±0.025、0.672±0.043、0.741±0.039;對照組細(xì)胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下凋亡率分別為0.266±0.027、0.568±0.055、0.671±0.046，兩組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001);Tunnel法檢測顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中大部分細(xì)胞膨脹，細(xì)胞核碎裂，對照組細(xì)胞

9、膜較完整，部分細(xì)胞呈空泡狀，細(xì)胞核濃縮，呈塊狀，少量細(xì)胞細(xì)胞核碎裂。
　　結(jié)論:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與單純PDT相比，PVP3+PDT聯(lián)合治療能顯著抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長增殖，并且能顯著增強(qiáng)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的凋亡。
　　第三章:P3聯(lián)合光動力治療對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞裸鼠移植瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:動物實(shí)驗(yàn)中比較VP3聯(lián)合PDT與單純PDT或VP3基因治療對鼻咽癌的療效，以進(jìn)一步證實(shí)VP3聯(lián)合PDT對鼻咽癌

10、的高效殺傷效果。
　　方法:構(gòu)建裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型，PDT處理后，測量并記錄腫瘤的大小、重量;HE染色比較各組移植瘤病理學(xué)特點(diǎn);免疫組化檢測移植瘤中apoptin的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.空載體質(zhì)粒組、PVP3質(zhì)粒組、CNE2/Mock+PDT和CNE2/VP3+PDT處理后0、3、7、14天時分別比較四組腫瘤體積，經(jīng)ANOVA方差分析，四組間腫瘤體積差異有顯著性意義，經(jīng)兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯

11、示CNE2/VP3+PDT處理組腫瘤體積與其他各組相比明顯減小(P＜0.001);且CNE2/VP3組腫瘤體積較CNE2/Mock組明顯減小(P＜0.001)。
　　2.四組移植瘤重量差異有顯著性意義，經(jīng)LSD方法進(jìn)行兩兩比較，CNE2/VP3+PDT處理組移植瘤重量與各對照組相比明顯減小(P＜0.001);CNE2/VP3組移植瘤重量較CNE2/Mock組明顯減小(P＜0.001)。
　　3.HE染色檢查發(fā)現(xiàn)CNE2/Mo

12、ck組移植瘤腫瘤細(xì)胞形態(tài)正常，瘤體內(nèi)見毛細(xì)血管豐富，未見明顯壞死組織;CNE2/VP3組移植瘤腫瘤細(xì)胞形態(tài)正常，可見少許壞死區(qū)域;CNE2/Mock+PDT組移植瘤見大量腫瘤細(xì)胞變性及核固縮，伴有部分片狀壞死區(qū)域;CNE2/VP3+PDT組移植瘤見大片狀壞死區(qū)域，僅少量癌細(xì)胞島殘留。
　　4.免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)CNE2/Mock組及CNE2/Mock+PDT組未見明顯apoptin蛋白表達(dá);CNE2/VP3組及CNE2/VP3+PD