腎移植受者移植前免疫狀態(tài)及其與移植腎功能關(guān)系研究.pdf

1、第一部分腎移植受者移植前外周血白細(xì)胞分型與腎移植預(yù)后關(guān)系
　　目的:腎移植受者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)對(duì)評(píng)估其罹患排斥反應(yīng)、腫瘤、感染或免疫抑制劑藥物中毒風(fēng)險(xiǎn)的高低十分重要。在腎移植臨床工作和科學(xué)研究的實(shí)踐中，對(duì)腎移植受者免疫狀態(tài)尤其是術(shù)后相關(guān)指標(biāo)的系統(tǒng)評(píng)估方法正逐漸完善。群體反應(yīng)性抗體的檢測(cè)已經(jīng)應(yīng)用于移植前受者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，而探尋其他移植前免疫檢測(cè)指標(biāo)也逐漸得到了學(xué)界的共識(shí)。腎移植受者在移植前淋巴細(xì)胞功能紊亂，表現(xiàn)為T細(xì)胞數(shù)顯著減少，CD4

2、+/CD8+比例降低，Th1/Th2比例升高，同時(shí)伴有初始T細(xì)胞和中央記憶T細(xì)胞細(xì)胞減少，CD4+CD28-T細(xì)胞比例增加。此種狀態(tài)導(dǎo)致T細(xì)胞免疫的減弱，從而增加術(shù)后移植腎功能延遲恢復(fù)或急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，影響腎移植預(yù)后。本部分旨在研究腎移植受者移植前白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分型與術(shù)后移植物功能恢復(fù)情況的關(guān)系，并探討其意義。
　　方法:收集2012年12月至2013年12月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科腎移植中心行同種異體腎移植術(shù)尿毒癥

3、患者的相關(guān)資料，檢測(cè)相關(guān)臨床生化指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞分型。根據(jù)腎移植受者術(shù)后6個(gè)月肌酐水平三分位數(shù)將患者分為術(shù)后6個(gè)月肌酐較低組(Group A: Cr≤95μmol/L)、肌酐中等組（Group B:95＜Cr≤139μmol/L）、肌酐較高組(GroupC:Cr＞139μmol/L)，并采用單因素方差分析方法、單因素線性分析及多因素Logistic回歸分析比較移植前白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞

4、、CD3+CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)及CD3+/CD4+比值與術(shù)后6個(gè)月肌酐的關(guān)系。
　　結(jié)果:術(shù)后6個(gè)月肌酐較低組移植前白細(xì)胞總數(shù)顯著低于肌酐較高組（5.36±0.67vs.7.3±1.32，p=0.010），移植前淋巴細(xì)胞數(shù)顯著低于肌酐較高組（0.93±0.46vs.1.86±0.47，p=0.005），移植前CD3+T細(xì)胞數(shù)顯著低于肌酐中等組及肌酐較高組（vs.Group B:61.60±38.35 vs.122.7

5、6±61.98，p=0.027; vs.Group C:61.60±38.35 vs132.99±43.94，p=0.012），移植前CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著低于肌酐中等組及肌酐較高組（vs.Group B:36.84±20.86 vs.70.86±29.39，p=0.013;vs.Goup C:36.84±20.86 vs.65.66±20.10,p=0.031），移植前CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著低于肌酐較高組(22.33±17

6、.53 vs.59.98±25.64,p=0.010)。移植前CD19+B細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞數(shù)及CD3+/CD4+比值在各組間無顯著性差異。
　　單因素線性分析顯示移植前白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、CD3+T細(xì)胞數(shù)、CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)與術(shù)后6個(gè)月肌酐值顯著正相關(guān)（p均＜0.05），移植前CD19+B細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞數(shù)及CD3+/CD4+比值與術(shù)后6個(gè)月肌酐值無顯著相關(guān)性。
　　進(jìn)一步術(shù)后6個(gè)月肌酐較

7、低組、肌酐中等組和肌酐較高組中對(duì)年齡、性別、高血壓、糖尿病、供腎類型、術(shù)前肌酐進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，顯示移植前白細(xì)胞總數(shù)在不同分組間不存在顯著性差異，而移植前淋巴細(xì)胞數(shù)、CD3+T細(xì)胞數(shù)、CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)在不同分組間存在顯著性差異（p均＜0.001）。
　　結(jié)論:腎移植受者移植前外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞型水平與術(shù)后腎功能水平密切相關(guān)。移植前淋巴細(xì)胞數(shù)、CD3+T細(xì)胞數(shù)、CD3+C

8、D4+T細(xì)胞數(shù)、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)較高的腎移植受者，術(shù)后6個(gè)月血清肌酐趨于維持在較高水平。因此，腎移植受者移植前免疫功能狀態(tài)可能影響移植腎預(yù)后，該結(jié)論尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。
　　第二部分ESRD患者外周血白細(xì)胞分類變化及淋巴細(xì)胞分型的相關(guān)因素分析
　　目的:腎移植受者在移植前ESRD期間因氧化應(yīng)激、尿毒癥毒素潴留、代謝紊亂等，存在免疫激活與免疫抑制并存的狀態(tài)，對(duì)各種免疫細(xì)胞功能有廣泛的影響，這種免疫功能紊亂可能影響移植

9、腎短期及長(zhǎng)期預(yù)后。本研究旨在比較ESRD患者與健康志愿者不同白細(xì)胞分類水平，分析ESRD患者淋巴細(xì)胞亞群水平的相關(guān)因素，探討影響腎移植受者移植前免疫細(xì)胞變化的因素。
　　方法:分別收集2012年12月至2013年12月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科腎移植中心行活體親屬腎移植術(shù)之健康供腎者及2012年10月至2013年6月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院之尿毒癥患者的相關(guān)資料，檢測(cè)相關(guān)臨床生化指標(biāo)，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞分

10、型。采用單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較ESRD患者與健康志愿者白細(xì)胞分類水平，采用雙變量相關(guān)分析淋巴細(xì)胞亞群與其他臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，采用多因素線性回歸分析T細(xì)胞分型與其他臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:在ESRD組和健康對(duì)照組間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)ESRD組外周血白細(xì)胞總數(shù)顯著高于健康對(duì)照組[(6.43±2.19)×109 vs.(5.67±1.39)×109，p=0.025]，中性粒細(xì)

11、胞數(shù)顯著高于健康對(duì)照組[(4.34±1.99)×109 vs.(3.28±1.26)×109，p=0.012]，淋巴細(xì)胞數(shù)顯著低于健康對(duì)照組[(1.45±0.55)×109 vs.(1.88±0.42)×109，p=0.007]，中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值顯著高于健康對(duì)照組(3.60±3.08 vs.1.83±0.85，p=0.007)。
　　在ESRD組與健康對(duì)照組中對(duì)年齡、性別因素回歸后，白細(xì)胞總數(shù)在組間不存在顯著性差異，而中性

12、粒細(xì)胞數(shù)(p=0.015)、淋巴細(xì)胞數(shù)(p=0.001)、NLR(p＜0.001)在組間仍有顯著性差異。
　　將ESRD組患者根據(jù)不同透析方式分為未透析組、血透組和腹透組，發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞數(shù)分別顯著高于未透析組（1.88±0.42 vs.1.49±0.65，p=0.002）、血透組（1.88±0.42 vs.1.45±0.48，p=0.023）和腹透組（1.88±0.42 vs.1.39±0.48，p=0.001）;而

13、不同透析組之間無顯著性差異。單因素相關(guān)性分析顯示ESRD患者外周血中性粒細(xì)胞數(shù)與糖尿病、CVD、血磷、NT-proBNP、hsCRP、降鈣素原等呈顯著正相關(guān)，與白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、25OH-vitD等呈顯著負(fù)相關(guān)（p均＜0.05）;淋巴細(xì)胞數(shù)與eGFR、血紅蛋白、前白蛋白、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、二氧化碳、血鈣、轉(zhuǎn)鐵蛋白等呈顯著正相關(guān)，與β2-微球蛋白、尿素、肌酐、NT-proBNP、hsCRP、iPTH、降鈣素原、促紅素等呈顯著負(fù)

14、相關(guān)（p均＜0.05）;B細(xì)胞數(shù)與收縮壓、eGFR、血紅蛋白、白蛋白、前白蛋白、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、轉(zhuǎn)鐵蛋白等呈顯著正相關(guān)，與年齡、β2-微球蛋白、尿素、肌酐、NT-proBNP、hsCRP、降鈣素原、促紅素等呈顯著負(fù)相關(guān)（p均＜0.05）。多因素線性回歸分析顯示CD3+T細(xì)胞數(shù)與收縮壓、BMI、肌酐、膽固醇、鈣呈獨(dú)立正相關(guān)，與吸煙史、舒張壓、β2-微球蛋白、白蛋白、尿素呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)（p均＜0.05）;CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)

15、與收縮壓、LDL-C呈獨(dú)立正相關(guān)，與高血壓史、舒張壓、β2-微球蛋白、尿素、hsCRP呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)(p均＜0.05);CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)與肌酐、膽固醇呈獨(dú)立正相關(guān)，與吸煙史、β2-微球蛋白呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)（p均＜0.05）。
　　結(jié)論:腎移植受者移植前免疫狀態(tài)和健康對(duì)照組不同，這可能與ESRD患者合并脂代謝紊亂、尿毒癥毒素潴留等因素有關(guān)。
　　第三部分硫酸吲哚酚和硫酸對(duì)甲酚對(duì)淋巴細(xì)胞增殖影響研究
　　目的:硫酸吲哚酚

16、和硫酸對(duì)甲酚是新近發(fā)現(xiàn)的兩種與蛋白質(zhì)結(jié)合的尿毒癥毒素，在慢性腎臟病及腎移植受者中，它們與腎功能密切相關(guān)。研究表明這兩種毒素可以激活固有免疫細(xì)胞，但有關(guān)其對(duì)適應(yīng)性免疫細(xì)胞影響的研究未見報(bào)道。本部分?jǐn)M探討硫酸吲哚酚和對(duì)甲酚對(duì)淋巴細(xì)胞增殖或凋亡是否存在影響，并初步探討此種影響是否呈時(shí)間或濃度依賴性。
　　方法:收集健康志愿者外周血標(biāo)本，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞后分離并培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，在5％ CO2、37℃的環(huán)境下用合適的細(xì)胞培養(yǎng)液及適宜濃度的

17、PHA培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，并在培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度的硫酸吲哚酚(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)或不同濃度的對(duì)甲酚(0.10mmol/L、0.25mmol/L、0.50mmol/L)，與淋巴細(xì)胞共同孵育，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，共同孵育12h、24h、48h結(jié)束后收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用CCK-8 kit檢測(cè)各孔淋巴細(xì)胞吸光度，評(píng)價(jià)其增殖或凋亡水平。
　　結(jié)果:在PHA刺激下，將IndS與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24h，

18、結(jié)果顯示IndS50μg/ml組淋巴細(xì)胞增殖度顯著高于空白對(duì)照組及IndS10μg/ml組(p均＜0.05); PC與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示PC0.50mmol/L組淋巴細(xì)胞增殖度顯著高于空白對(duì)照組及PC0.10mmol/L組（p均＜0.01）。IndS與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，IndS10μg/ml組淋巴細(xì)胞增殖度顯著高于空白對(duì)照組(p＜0.05)，然而與各個(gè)高濃度組無顯著性差異，高濃度IndS組與空白對(duì)照組亦無顯

19、著性差異。IndS與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，不同濃度IndS組淋巴細(xì)胞增殖度顯著高于空白對(duì)照組（p均＜0.01），各組間無顯著性差異。PC與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12h或48h后，不同濃度PC組淋巴細(xì)胞增殖度顯著高于空白對(duì)照組（p均＜0.01），各組間無顯著性差異。
　　結(jié)論:在體外條件，適宜濃度PHA刺激下，硫酸吲哚酚和對(duì)甲酚會(huì)促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞的增殖，并且共培養(yǎng)24h時(shí)硫酸吲哚酚和對(duì)甲酚對(duì)淋巴細(xì)胞的促增殖作用呈濃度依賴性