腎移植受者部分免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)與Trans-vivoDTH的對(duì)比研究.pdf

1、目的：腎移植是目前終末期腎功能衰竭患者的重要替代治療，但是排斥反應(yīng)是器官移植后面臨的重大難題。免疫抑制劑的應(yīng)用雖然降低了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，但是并沒(méi)有明顯改善移植受者的長(zhǎng)期生存，這主要是由于非特異性免疫抑制劑的毒副作用所致。減少免疫抑制劑毒副作用的最理想方案是誘導(dǎo)免疫耐受的形成，但是在臨床還無(wú)法常規(guī)實(shí)現(xiàn)。所以根據(jù)患者的免疫功能狀態(tài)有針對(duì)性地個(gè)體化使用免疫抑制劑，既有效防止免疫抑制不足誘發(fā)的排斥反應(yīng)又避免了免疫抑制過(guò)度所產(chǎn)生的藥物毒副作

2、用。受者的免疫狀態(tài)是個(gè)體化用藥的重要依據(jù)，尋找簡(jiǎn)便實(shí)用可靠的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)一直是移植界努力的方向。轉(zhuǎn)移體內(nèi)遲發(fā)超敏反應(yīng)檢測(cè)法(Trans vivo delayed typehypersensitivity assay，Trans-vivo DTH)是公認(rèn)的一種可靠的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)方法，但該方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程涉及到動(dòng)物(裸鼠)，且步驟煩瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，臨床應(yīng)用受到很大限制，主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。目前臨床仍然停留在依據(jù)受者的血肌酐水平和免疫抑制藥物濃

3、度監(jiān)測(cè)對(duì)免疫抑制劑的用量進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性調(diào)整，使得部分移植耐受患者仍舊長(zhǎng)期終身使用較大劑量的免疫抑制劑，在造成藥物毒副作用的同時(shí)還導(dǎo)致醫(yī)療資源的極大浪費(fèi)。本研究將Trans-vivo DTH 做為判斷腎移植受者免疫狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例、PRA水平、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)組上清液中IL-2水平以及受者尿液標(biāo)本中差異蛋白的臨床應(yīng)用價(jià)值，試圖尋找能夠替代Trans-vivo DTH的指標(biāo)，用于臨床免疫

4、耐受的監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)腎移植后臨床免疫抑制劑的運(yùn)用。
　　 本研究收集30例2005年1月至2008年12月在第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎科接受親體腎移植的供受者外周血。受者年齡26～50歲，入組時(shí)均得到患者的知情同意。受者腎功能穩(wěn)定，肌酐水平在39～147 umol/L。
　　 材料和方法：
　　 第一部分 轉(zhuǎn)移體內(nèi)遲發(fā)超敏反應(yīng)檢測(cè)(Trans vivo delayed type hypersensitivityass

5、ay，Trans-vivo DTH)：將移植后受者外周血中分離的PBMCs與供者抗原一起注入免疫缺陷的小鼠(BALB/C 裸鼠)腳掌皮下，受者細(xì)胞對(duì)供者抗原反應(yīng)后產(chǎn)生DTH 反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定局部腫脹程度定量檢測(cè)受者對(duì)于供者免疫反應(yīng)強(qiáng)度。以PBS和回憶抗原(破傷風(fēng)毒素)注入作為對(duì)照。分別于注射后24 h，以游標(biāo)卡尺分別測(cè)量免疫缺陷小鼠(BALB/c 裸鼠)4只腳掌炎性腫脹的厚度。裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度小于2.54×10-2 mm為低敏組，

6、大于2.54×10-2 mm為高敏組。
　　 第二部分：
　　 腎移植受者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例檢測(cè)：受者PBMCs（1×106個(gè))，按照CD4+CD25+Foxp3+Treg 染色試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，分別進(jìn)行胞外CD4/CD25抗體和胞內(nèi)Foxp3抗體染色，然后在流式分析儀上檢測(cè)并分析；腎移植受者外周血中群體反應(yīng)性抗體(PRA)水平檢測(cè)：采用ELISA 法檢測(cè)腎移植術(shù)后受者血清中PRA水平。結(jié)

7、果解釋：PRA（％)=(陽(yáng)性反應(yīng)孔數(shù) ÷40)×100％PRA≤10％為陰性，PRA＞10％為陽(yáng)性；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)反應(yīng)組上清液中IL-2水平檢測(cè)：用密度梯度離心法得到供受者外周血PBMCs，建立MLC 模型，在MLC 第2，4，6天分別收集培養(yǎng)液上清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定人IL-2水平。
　　 第三部分 腎移植受者尿液中蛋白質(zhì)譜分析：
　　 在留取外周血液標(biāo)本時(shí)同時(shí)留取腎移植受者尿液標(biāo)本100

8、ml，放-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。尿液?biāo)本經(jīng)過(guò)離心去沉淀，過(guò)濾去雜質(zhì)，抽濾除菌，濃縮凍干，尿素溶液清洗除鹽等前期處理后進(jìn)行雙向電泳，ImageMaster 軟件分析，尋找差異蛋白斑點(diǎn)，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，尋找差異蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：根據(jù)裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度將實(shí)驗(yàn)病例劃分為低敏組和高敏組。兩組裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度分別為1.72±0.44(×10-2 mm)，8.05±2.26(×10-2 mm)；

9、r>　　 第二部分：
　　 (1) 低敏組和高敏組受者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例分別為9.23±1.79(％)，1.03±1.04(％)；低敏組和高敏組的外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例差異顯著，P<0.05；
　　 (2) 低敏組受者外周血中PRA的百分比均小于10％(2個(gè)標(biāo)本除外)，高敏組的7例受者外周血中PRA 比例均大于10％。低敏組和高敏組的外周血中PRA 比例差

10、異顯著，P<0.05；(3) 成功建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑹占锨逡?。高敏組MLC中反應(yīng)組細(xì)胞上清液中IL-2水平在培養(yǎng)的2，4，6天分別為0.889±0.070，1.637±0.214，1.069±0.100；低敏組MLC中反應(yīng)組細(xì)胞上清液中IL-2水平在培養(yǎng)的2，4，6天分別為0.738±0.065，0.988±0.117，0.868±0.104。高敏組IL-2水平明顯高于低敏組，兩組中反應(yīng)組細(xì)胞的IL-2水平差異顯著，P<0

11、.05；
　　 第三部分：質(zhì)譜分析得到低敏組和高敏組的雙向電泳圖譜中四個(gè)有意義的差異蛋白．低敏組表達(dá)升高的是SERPINA1亞型3 α-1-抗胰蛋白酶和人補(bǔ)體因子B(CFBComplement factor B)，高敏組表達(dá)升高的是AZGP1(鋅-α-2-糖蛋白)和SERPINC1Antithrombin-III(絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子-抗凝血酶-III)。
　　 結(jié)論：
　　 1、受者外周血中CD4+

12、CD25+FoxP3+Treg的比例與受者對(duì)供者免疫反應(yīng)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例越高，發(fā)生排斥反應(yīng)的可能性就越小。
　　 2、低敏組和高敏組的腎移植受者，其外周血中PRA水平有顯著差異，可用于免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。
　　 3、低敏組的檢測(cè)MLC 反應(yīng)組細(xì)胞上清液中IL-2水平較高敏組低，說(shuō)明MLC 反應(yīng)組細(xì)胞上清液中IL-2水平可以作為腎移植術(shù)后預(yù)測(cè)排斥反應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)。