腎移植受者HCMV感染與BAFF信號(hào)活化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　研究腎移植受者人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染與B細(xì)胞活化因子（B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF）信號(hào)的相關(guān)性。
　　方法：
　?、僖詠?lái)院隨訪的腎移植受者為研究對(duì)象，共采集113例患者抗凝外周血（EDTA-Na2抗凝）和尿液樣本。采用real-time PCR法檢測(cè)尿液中HCMV DNA水平。

2、
　?、趹?yīng)用real-time PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信號(hào)和BAFF信號(hào)通路中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄本水平；PCR芯片技術(shù)對(duì)TLR信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路，以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路中共88個(gè)基因進(jìn)行研究，以篩選腎移植受者HCMV DNA陽(yáng)性組和陰性組的差異表達(dá)基因。健康志愿者為對(duì)照。
　?、跡LISA法檢測(cè)血清sBAFF和總IgG水平；間接熒光

3、免疫試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)血清中抗HCMV pp65 IgG、IgM抗體水平，流式熒光法（Luminex）檢測(cè)血清抗人類(lèi)白細(xì)胞抗原HLA抗體和抗MICA抗體水平（抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗體）。
　?、懿捎肧PSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法及Pearson法；P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、?13例來(lái)院隨訪腎移植病人中，尿HC

4、MV DNA>10,000拷貝/ml為12例，歸為陽(yáng)性組；HCMV DNA<10,000拷貝/ml的為83例，以及未出現(xiàn)擴(kuò)增的18例，歸為陰性組。
　?、贓LISA結(jié)果顯示，陽(yáng)性組患者血清sBAFF、總IgG水平顯著高于陰性組（928±360 pg/ml vs511±298 pg/ml,P<0.05;26,260±15,960μg/ml vs9,944±7,365μg/ml, P<0.05）；IFA結(jié)果顯示，陽(yáng)性組患者血清抗HCM

5、V pp65 IgG水平顯著高于陰性組（P<0.05）；陽(yáng)性組中尿HCMV DNA拷貝數(shù)與sBAFF呈正相關(guān)（r=0.988,P<0.05），sBAFF與血清中總IgG呈正相關(guān)（r=0.625, P<0.05）。
　?、跮uminex檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性組中抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗體的陽(yáng)性率為46.2％，陰性組為12.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　④real-time PCR發(fā)現(xiàn)，與尿HCMV DNA陰性組比較，陽(yáng)性組BA

6、FF mRNA水平顯著增高（P<0.05），其余分子（BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等）的表達(dá)未出現(xiàn)顯著差異；基因芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)差異基因共有46個(gè)，其中陽(yáng)性組與陰性組相比較表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè)（BAFF-R、ICAM1），表達(dá)下調(diào)的基因22個(gè)（TLR-9、NLRC5、LIGHT等）；陽(yáng)性組與健康對(duì)照組相比較，表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè)（IFN-γ、ICAM1），表達(dá)下調(diào)的基因8個(gè)（CCL3L1、IL12B、ILIR1等

7、）；陰性組與健康對(duì)照組相比較表達(dá)上調(diào)的基因有11個(gè)（IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等），表達(dá)下調(diào)的基因1個(gè)（BAFF-R）。
　　結(jié)論：
　　腎移植受者HCMV感染后，HCMV-TLR信號(hào)活化可能引發(fā)或促進(jìn)BAFF信號(hào)活化；HCMV-TLR信號(hào)與BAFF信號(hào)獨(dú)立或協(xié)作參與移植腎損傷。
　　第二部分
　　目的：體外探索HCMV-TLR9信號(hào)與BAFF信號(hào)串話的可能機(jī)制和效應(yīng)。
　　方法：
　?、貶

8、CMV感染HFL-1細(xì)胞，以無(wú)HCMV感染的HFL-1細(xì)胞作對(duì)照。在感染第1，3，5，7天時(shí)收獲細(xì)胞，提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同時(shí)相的表達(dá)水平變化。
　　②HCMV直接感染人扁桃體B淋巴細(xì)胞，或以HCMV感染后的HFL-1細(xì)胞與扁桃體B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)第1，3，5，7天后收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清。流式分析各個(gè)時(shí)相B細(xì)胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BA

9、FF-R+、TACI+、BCMA+的表達(dá)強(qiáng)度；ELISA檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞培養(yǎng)上清的IgG分泌水平。另外，用5μg/ml CpG ODN2006及其陰性對(duì)照，2.5μg/ml CpG ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C)，及200 ng/ml重組BAFF蛋白體外作用于B細(xì)胞作為對(duì)照。
　　③采用中和性抗BAFF-R抗體在HCMV或CpG ODN2006感染B細(xì)胞之前或之后阻抑BAFF信號(hào)，繼續(xù)培養(yǎng)5天，收集相應(yīng)

10、的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別用流式和ELISA檢測(cè)B細(xì)胞凋亡率和分泌IgG水平，以分析HCMV感染、BAFF信號(hào)串話對(duì)B細(xì)胞生長(zhǎng)及功能的影響；以HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨(dú)作用作為對(duì)照，以不加任何刺激劑作為空白對(duì)照。體外實(shí)驗(yàn)用來(lái)分析HCMV感染對(duì)B細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　④采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)；多組實(shí)驗(yàn)間采用ANOVA方法進(jìn)行兩兩比較；P<0.

11、05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、賅estern Blot結(jié)果顯示HCMV感染HFL-1細(xì)胞后，TLR9的表達(dá)水平隨感染時(shí)間先升高后下降，TRAF6和IRAK4則隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)（時(shí)相間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），NLRC5水平則未出現(xiàn)明顯變化；對(duì)照組中各蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間均未出現(xiàn)明顯變化。
　?、谂cHCMV感染的HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率在培養(yǎng)的第1-3天和第5-7天間出現(xiàn)顯著的上升，但在第0-1天、第

12、3-5天之間則出現(xiàn)平臺(tái)期；與正常HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。HCMV直接刺激B細(xì)胞，B細(xì)胞的早期凋亡率在第1-5天未出現(xiàn)明顯上升；CpG ODN2006直接刺激B細(xì)胞，B細(xì)胞的早期凋亡率在第0-1天下調(diào)，第1-5天緩慢上調(diào)；CpG ODN2006 Control和rhBAFF直接刺激B細(xì)胞，B細(xì)胞的早期凋亡率與不加任何制劑刺激相比無(wú)顯著差異；CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B細(xì)胞的凋亡率持續(xù)上

13、升，且在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)高于對(duì)照組；對(duì)照組中未用任何制劑刺激的B細(xì)胞早期凋亡率持續(xù)上升。
　　③HCMV直接或間接感染 B細(xì)胞，B細(xì)胞表面BAFF-R持續(xù)高水平表達(dá)；受 rhBAFF和 CpG ODN2006刺激的B細(xì)胞 BAFF-R表達(dá)水平與HCMV感染類(lèi)似。CpG ODN2006 Control、CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激組和對(duì)照組中B細(xì)胞BAFF-R表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯規(guī)律。B細(xì)胞表面BAFF及其受體TAC

14、I、BCMA的表達(dá)水平在各實(shí)驗(yàn)組中均未發(fā)現(xiàn)明顯變化趨勢(shì)。
　　④HCMV刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號(hào)，B細(xì)胞凋亡率上升，但I(xiàn)gG分泌水平無(wú)顯著變化；CpG ODN2006刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號(hào)，B細(xì)胞凋亡率顯著上升，IgG分泌水平顯著下降；HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨(dú)刺激B細(xì)胞對(duì)其早期凋亡率無(wú)顯著影響，HCMV、CpG ODN2006單獨(dú)刺激B細(xì)胞后B細(xì)胞IgG分泌水平上調(diào)。
　　結(jié)論：