腎移植受者術前MICA抗體陽性對移植后早期急性排斥反應的影響.pdf

1、目的和意義:
　　 外科技術的不斷進步和新型免疫抑制劑的產(chǎn)生，腎臟移植已經(jīng)成為臨床上治療腎功能衰竭的最有效手段。急性排斥反應是腎移植術后常見的并發(fā)癥，是導致移植物功能喪失和長期存活失敗的重要危險因素之一。排斥反應分為細胞性排斥反應和體液性排斥反應，其中細胞免疫在排斥反應過程中起著重要作用，但體液免疫在腎移植術后排斥反應中也起著非常重要的作用。一般認為針對人類組織相容性抗原(Humanleucocyteantigen，HLA)的抗

2、體為與腎移植術后排斥反應及移植腎存活率密切相關的體液性因素，特別是移植前受者體內針對供者的特異性抗體可以導致超急性排斥反應發(fā)生。然而，即便是供受者之間HLA基因完全匹配，腎移植術后排斥反應仍可能發(fā)生。因此，人們認識到一些非HLA抗體也可以介導體液性排斥反應。MIC基因位于人體6號染色體上，是跨越人類組織相容復合物1(MHC-Ⅰ)類2Mb長度區(qū)域的基因家族，此家族與經(jīng)典的HLA-Ⅰ類基因同源性很高，但分子結構和功能不同，它包括MICA、M

3、ICB、MICC、MICD、MICE、MICF6個成員，其中只有MICA和MICB編碼、表達。MIC基因編碼產(chǎn)物結構與MHC-Ⅰ類分子結構類似，含383-389個氨基酸的多肽，包含有3個胞外結構域(α1，α2，α3)，α1、α2形成了抗原結合部位。MIC基因編碼的分子是與NKG2D分子相結合，不與T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)相結合，不與β2微球蛋白相連，不與肽段結合，與抗原加工相關轉運體(transporterass

4、ociatedwithantigenprocessing，TAP)無關。MICA基因具有高度多態(tài)性，目前至少發(fā)現(xiàn)61個等位基因，其多態(tài)性主要體現(xiàn)在外顯子3，4和跨膜區(qū)的微衛(wèi)星序列。經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子廣泛分布于人體有核細胞，MICA基因主要表達于上皮細胞和成纖維細胞，尤其是腸道上皮細胞，也表達在大多數(shù)上皮性腫瘤細胞（胃癌、肺癌等）中，并主要與活化的巨噬細胞、CD8+T細胞以及NK細胞上的NKG2D/DAP10受體結合，激活這些細胞的細

5、胞毒作用，誘導合成INF-γ等細胞因子，破壞移植物功能。MICA基因還存在明顯的種族差異性，白種人群中MICA的多態(tài)性，MICA008基因頻率最高(53％)、MICA002(13％)、MICA009(3％)日本人群中MICA008基因頻率最高(30.8％)、MICA009(16.5％)、MICA007最罕見。主要組織相容性復合體Ⅰ類相關鏈A抗原(majorhistocompatibilitycomplexclassⅠ-relatedch

6、ainA，MICA)作為目前非HLA抗原中重要的具有高度多態(tài)性的糖蛋白抗原，是細胞和體液免疫應答的多態(tài)性分子。MICA抗原可能在移植排斥中通過激活抗體介導或細胞介導的免疫反應而起作用。Hankey等通過免疫組化的方法檢測移植腎臟或胰腺組織中MICA基因表達，在所有出現(xiàn)急性腎小管壞死(ATN)以及急性排斥反應的患者組織中都出現(xiàn)MICA基因的表達，在正常腎臟組織中沒有MICA基因的表達，提示細胞表面MICA基因表達與細胞損傷之間存在關聯(lián)。M

7、ICA抗原作為一個多態(tài)性抗原，能夠誘導移植腎患者產(chǎn)生特異性抗體。有研究證實許多配型良好的移植患者近期急性排斥反應和遠期慢性移植物血管病發(fā)生率卻高于配型不佳的移植患者，盡管大多數(shù)發(fā)生排斥反應的腎移植受體會產(chǎn)生HLA抗體，但部分不產(chǎn)生HLA抗體卻發(fā)生移植排斥的受者中有1/3以上存在MICA抗體，2005年KazuoMizutani對腎移植受者發(fā)生排斥反應的腎臟透析洗脫液的研究發(fā)現(xiàn)MICA抗體與移植腎功能和存活有關，也參與了排斥反應過程中的變

8、化，提示MICA抗體可能影響移植腎存活率，2007年Arundhati回顧性的研究了185例腎移植術后患者血清標本，發(fā)現(xiàn)MICA抗體陽性組患者AR發(fā)生率為33％，MICA抗體陰性組AR發(fā)生率為14％(P=0.03)。以上研究均證明MICA抗體與腎移植術后排斥反應和移植物丟失具有明顯相關性。所以MICA抗體與腎移植的關系更值得關注。本課題就MICA抗體在等候腎臟移植的人群中的抗體特異性分析及術前MICA抗體對腎移植術后早期急性排斥反應發(fā)生

9、、移植腎功能的影響等方面展開一些探討和研究。
　　 第一部分MICA抗體在等候腎臟移植受者中的抗體特異性分析
　　 方法:
　　 選取2009年12月-2010年10月行MICA抗體檢測及MICA抗體特異性分析的197例腎移植受者。MICA熒光微球由鄒義洲教授惠贈，包被10種MICA抗原，即MICA001,MICA002,MICA004,MICA007,MICA009,MICA012,MICA0015、MICA0

10、17，MICA018，MICA019，MICA027。采用液相芯片分析技術，在包被已知MICA抗原的熒光微球中加入患者血清，再加入R-藻紅蛋白(PE)標記的羊抗人IgG，重懸熒光微球，Luminex機上閱讀。使用DataCollectorVersion1.7軟件進行數(shù)據(jù)采集，以雙色激光分別讀取每個MICA抗原＞100個微球，經(jīng)分子PE熒光強度獲得cut-off分值，判讀出0、2、4、8，將OD值≥4定為抗MICA抗體陽性，并獲得抗MIC

11、A抗體特異性。根據(jù)抗MICA抗體是否陽性分為抗MICA抗體(+)組和抗MICA抗體(-)組，在MICA抗體(+)組中計算各特異性MICA抗體的頻率（某特異性抗體出現(xiàn)頻率=該特異性抗體出現(xiàn)次數(shù)/所有特異性抗體出現(xiàn)的總次數(shù)）及表達單特性抗體、多特異性抗體的受者占所有MICA抗體陽性者的百分比。
　　 結果:
　　 197例術前的腎移植受者中，45例檢測到MICA抗體，陽性率為22.84％。檢測的MICA抗體分別為:1例為MI

12、CA007、027;1例為MICA001、002、007、012、017、018、019;1例為MICA001;2例為WeakMICA001;4例為WeakMICA019;1例為MICA007、weak027;9例為MICA019;1例為MICA019、027、weak004、009;1例為MICA001、weak019;1例為MICA002、019;2例為MICA002、018、007、019、001、012、017、015、027、

13、004、009;1例為MICA019、027、004、009、002、007、018;1例為MICA001、018、004、009、027;1例為MICA001、018、012;1例為MICA027、009、004、019;2例為MICA027、009、004;1例為001、002、018、027;1例為004、009、027、019、007、018;1例為MICA007;1例為MICA015;1例為MICA002、018、019。其中

14、單特異性MICA抗體有18例，多特異性MICA抗體（特異性抗體≥2個）有17例。MICA019抗體頻率為65.7％(23/35)、MICA027抗體頻率為34.3％、MICA001抗體頻率為28.6％，MICA004、009、018抗體頻率為25.7％，MICA007抗體頻率為22.9％，MICA002抗體頻率為20％，MICA012抗體頻率為11.4％，MICA015、017抗體頻率均為8.6％。常見為MICA019、027、001、

15、004、009、018等抗體。45例陽性受者中單特異性抗體18例(51.4％)，多特異性抗體17例(48.6％)。
　　 第二部分MICA抗體對腎移植術后影響的相關性研究
　　 方法:
　　 檢測2009-2010年本院197例未使用免疫抑制劑的腎移植受者術前MICA抗體及其特異性，隨訪其中139例接受腎移植手術的受者術后早期急性排斥反應(AR)和移植腎功能。根據(jù)抗MICA抗體是否陽性分為抗MICA抗體(+)組和

16、抗MICA抗體(-)組。MICA抗體檢測采用液相芯片分析技術，在包被已知MICA抗原的熒光微球中加入患者血清，再加入R-藻紅蛋白(PE)標記的羊抗人IgG，重懸熒光微球，Luminex機上閱讀。使用DataCollectorVersion1.7軟件進行數(shù)據(jù)采集，以雙色激光分別讀取每個MICA抗原＞100個微球，經(jīng)分子PE熒光強度獲得cut-off分值，判讀出0、2、4、8，將OD值≥4定為抗MICA抗體陽性，并獲得MICA抗體特異性。采

17、集139例移植受者年齡、性別、術后免疫抑制方案、早期急性排斥反應(AR)發(fā)生與否，術后7d內的血肌酐及24小時尿量、移植腎功能恢復時間等資料，兩組間比較。AR抗排斥治療方案:給予甲基強的松龍(MP)沖擊治療，劑量為0.5g、0.25g、0.25g，連續(xù)3d。如果腎功能無明顯好轉或繼續(xù)惡化，使用環(huán)磷酰胺沖擊治療，療程3-5d，并血液透析過渡等綜合治療。統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行，計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，

18、計數(shù)資料比較采用x2檢驗、校正x2檢驗或Fisher確切概率檢驗，重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 已知MICA抗體情況的197例受者中有139例接受移植，均為尸體供腎，供受者ABO血型相同，術前淋巴細胞毒試驗陰性?；颊咝g后免疫抑制方案均為:抗胸腺細胞球蛋白(ATG)+他克莫司(Tacrolimus，Tac)+霉酚酸酯(Mycophenolate，MMF)+強的松(Pre

19、dnisone，Pred)。移植受者兩組間年齡、性別等因素差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。其中39例發(fā)生了早期AR(平均急排率28.1％)。45例MICA抗體陽性受者中有38例接受移植，其中14例發(fā)生了早期AR(急排率36.8％);152例MICA抗體陰性受者中有101例接受移植，其中25例發(fā)生早期AR（急排率24.8％）;MICA抗體陽性與MICA抗體陰性之間早期AR率差異無顯著統(tǒng)計學意義。18例單特異性抗體受者中有4例發(fā)生早期AR

20、(急排率22.2％)，17例多特異性抗體受者中有7例發(fā)生早期AR（急排率41.2％），兩組急排率差異無顯著統(tǒng)計學意義(x2=1.46，P＞0.05)。而美國Zou等報道254例受者免疫抑制藥物有效濃度治療下的MICA抗體陽性率為13.4％，兩組間差異顯著(x2=6.867,P=0.009＜0.01)。
　　 參與術后隨訪的MICA抗體陽性受者共38例，其中7例因無法獲取病例血肌酐資料而導致數(shù)據(jù)丟失，已知資料31例MICA抗體陽性

21、受者術后1周內血肌酐水平，參與術后隨訪的MICA抗體陰性受者101例，其中19例因無法獲得病例血肌酐資料而導致數(shù)據(jù)丟失，已知資料82例MICA抗體陰性受者術后1周內血肌酐水平，兩組術后1周內血肌酐比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.001，P=0.979＞0.05)，說明組別效應在術后1周不同時間內的對血肌酐的影響效應相同（圖4.1，表4.1）;兩組時間差異有顯著統(tǒng)計學差異(F=216.053，P=0.000＜0.05)，說明術后不同時間的血

22、肌酐水平之間有差異。時間和組別無交互作用(F=0.797，P=0.363＞0.05)，提示組別差異不隨時間變化而變化，提示術后第7天兩組血肌酐之間的差異無統(tǒng)計學意義。已知資料31例MICA抗體陽性受者術后1周內尿量，因20例受者無法獲得病例尿量資料而導致數(shù)據(jù)丟失，已知資料81例MICA抗體陰性受者術后1周內尿量，兩組術后1周內尿量比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.006，P=0.940＞0.05)說明組別效應對術后1周內尿量水平的影響相同（

23、圖4.2，表4.2）;兩組時間差異無統(tǒng)計學意義(F=49.654，P=0.000＜0.05)，說明術后不同時間的尿量水平有差異。時間和組別無交互作用(F=0.122，P=0.947＞0.05)，提示組別差異不隨時間變化而變化，提示術后第7天兩組尿量之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 18例中9例無法獲得血肌酐數(shù)據(jù)導致數(shù)據(jù)丟失，已知資料9例單特異性抗體受者術后7d血CR(202.9±130.2)umol/L，17例中3例無法獲得血肌酐

24、資料導致數(shù)據(jù)丟失，已知資料14例多特異性抗體受者術后7d血CR（193.3±135.9）umol/L，兩組術后7d血CR比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.168，P=0.868＞0.05)已知資料9例單特異性抗體受者術后7d尿量(2752.8±594.6)mL，已知資料14例多種特異性抗體受者術后7d尿量（2838.1±698.0）mL，兩組術后7d尿量比較差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.302，P=0.765＞0.05）;18例單特異抗體組中

25、6例無法獲取移植腎恢復時間資料，已知資料12例單特異性抗體組移植腎功能恢復時間為(14.0±14.2)天，17例多特異性抗體組移植腎功能恢復時間為（20.0±21.5）天，兩組移植腎功能恢復時間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.842，P=0.407＞0.05）。
　　 結論:
　　 等候腎移植受者術前MICA抗體陽性率22.84％。MICA抗體中抗MICA019抗體頻率65.7％。推測MICA019為人群分布中較常見基因

26、，是表現(xiàn)高頻率抗體的原因。MICA抗體單特異性與多特異性比例接近(51.4％vs48.6％)，提示MICA抗體的產(chǎn)生不是單一途徑，可能包含多種因素，說明應對抗體產(chǎn)生途徑進行深入探討。雖然MICA抗體陽性組與陰性組相比早期AR率之間差異無顯著性，但是移植受者術前MICA抗體陽性對增加移植后早期AR率(28.1％↑36.8％，24.8％↑36.8％)具有獨立的影響，早期AR率的增加幅度為8.7％～12％，具有臨床意義。因此，臨床醫(yī)生應重視腎