CXCL9的表達(dá)、純化及其抗體對(duì)大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：建立一種穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便的不借助外科顯微鏡下的大鼠腎移植模型，并評(píng)價(jià)其效果。 方法：以SD大鼠和Wistar大鼠分別作為供、受體。從腹主動(dòng)脈原位灌注4℃肝素林格氏液。移植時(shí)，靜脈用臨時(shí)支架管（硬膜外導(dǎo)管），將供腎的下腔靜脈與受體左腎靜脈作端端吻合，供腎腹主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，以及輸尿管帶膀胱瓣與膀胱吻合。 結(jié)果：共完成105次腎臟移植手術(shù)，其中前期40次，主要是探索手術(shù)方法和訓(xùn)練顯微外科技術(shù)，總結(jié)圍手術(shù)期處理

2、經(jīng)驗(yàn)。后期65次，手術(shù)時(shí)間（130±16）min，，熱缺血時(shí)間小于20s，冷缺血時(shí)間小于50min，手術(shù)成功率90.77％。建立并改進(jìn)了大鼠腎移植模型。 結(jié)論：此模型手術(shù)操作簡(jiǎn)單、便捷、直觀(guān)，簡(jiǎn)化了顯微外科技術(shù)的設(shè)備要求，可應(yīng)用于移植相關(guān)研究。 目的：探討大鼠腎移植手術(shù)前后趨化因子CXCL9及其受體CXCR3mRNA的動(dòng)態(tài)變化與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 方法：以BN和LEW大鼠作為供體，LEW大鼠作為受體，建立大鼠同

3、種異體腎移植模型。采用ELISA法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分別動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠術(shù)前后血清CXCL9和外周血淋巴細(xì)胞CXCR3 mRNA的變化。另外同時(shí)檢測(cè)血清肌酐水平。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠血清CXCL9，外周血淋巴細(xì)胞CXCR3 mRNA及血清肌酐表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。術(shù)前血清CXCL9和外周血淋巴細(xì)胞CXCR3 mRNA在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），術(shù)后第1，3

4、，5，7天實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)前及術(shù)后第1天血清肌酐在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，術(shù)后第3，5，7天實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05） 結(jié)論：血清CXCL9和外周血淋巴細(xì)胞CXCR3 mRNA的表達(dá)與排斥反應(yīng)密切相關(guān)，可以作為早期診斷急性排斥反應(yīng)的輔助敏感指標(biāo)。 目的：構(gòu)建大鼠CXCL9的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)于BL21（DE3）中。表達(dá)的目的蛋白SDS-P

5、AGE電泳分離純化后免疫大白兔，獲得大鼠CXCL9抗血清（多克隆抗體）。 方法：人工合成的大鼠CXCL9 cDNA片段被克隆至pET32a（+），重組pET32a（+）/CXCL9轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白，親和層析純化重組蛋白。純化后的重組蛋白與免疫佐劑混合后主動(dòng)免疫大白兔，制備CXCL9抗血清，ELISA和Western blotting檢測(cè)抗體的特異性。 結(jié)果：經(jīng)基因克隆及重組技術(shù)

6、，獲得了CXCL9融合蛋白，其表達(dá)形式為無(wú)可溶性包涵體，此包涵體蛋白經(jīng)Ni2+親和層析能有效純化；以該蛋白免疫大白兔制備了CXCL9抗血清。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組CXCL9表達(dá)載體，獲取了重組CXCL9蛋白，制備了高效價(jià)的CXCL9抗血清。為其進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 目的：探討CXCL9抗血清（多克隆抗體）對(duì)大鼠移植急性排斥反應(yīng)的影響，明確CXCL9在腎移植急性排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。 方法：以Brown-Norw

7、ay（BN）大鼠為供體，Lewis（LEW）大鼠為受體，建立大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型。受體隨機(jī)分為4組，（1）Ⅰ組：急性排斥對(duì)照組，腹腔注射正常大白兔血清5ml.kg-1.d-1；（2）Ⅱ組：抗CXCL9血清5ml.kg-1.d-1腹腔注射組；（3）Ⅲ組：環(huán)孢菌素（Cyclosporine，CsA）2mg.kg-1.d-1肌肉注射治療組；（4）Ⅳ組為：抗CXCL9血清+CsA組，劑量和方法同上Ⅱ組和Ⅲ組。觀(guān)察術(shù)后4組大鼠存活時(shí)間，

8、術(shù)后第5天移植腎組織病理改變，檢測(cè)血肌酐/尿素氮（Cr/BUN）、IL-2表達(dá)水平，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在移植腎內(nèi)浸潤(rùn)情況，CXCR3 mRNA在移植腎組織中的表達(dá)水平，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖活性。 結(jié)果：Ⅱ組、Ⅳ組受體鼠存活時(shí)間分別為（11.75±1.26）d和（18.25±1.70）d，較對(duì)照組Ⅰ組（8.00±0.82d）明顯延長(zhǎng)（P<0.05）；Ⅱ組、Ⅳ組移植腎病理分級(jí)評(píng)分分

9、別為（3.25±0.96）和（1.25±0.50），與對(duì)照組Ⅰ組（5.50±0.58）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ組、Ⅳ組移植后第5天Cr水平分別為（131.87±7.48）μmol/L和（59.83±7.70）μmol/L，明顯低于對(duì)照組Ⅰ組（332.16±45.14）μmol/L（P<0.01）。Ⅰ組移植腎CXCR3 mRNA表達(dá)明顯高于其他三組，Ⅳ組與Ⅱ組、Ⅲ組相比較，差異有顯著性（P<0.05）。外周血IL-2表達(dá)水平：Ⅰ組水平最高，

10、與其他組相比較，差異有顯著性（P<0.01），Ⅳ組與Ⅱ組、Ⅲ組相比較，差異有顯著性（P<0.05）。與Ⅰ組相比，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組移植腎CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯下降（P<0.05），Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。Ⅱ組、Ⅳ組淋巴細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組Ⅰ組明顯減弱，差異有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論：CXCL9抗體可能通過(guò)中和受體大鼠體內(nèi)CXCL9，阻止了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞向移植物浸潤(rùn)