嵌合HAdV六鄰體抗原表位rFLU-HAdV-Hexon疫苗株的拯救及免疫效果研究.pdf

1、應(yīng)用PR8流感病毒為疫苗載體，將腺病毒六鄰體保護(hù)性抗原表位重組到PR8流感病毒NS1基因中，拯救表達(dá)腺病毒六鄰體保護(hù)性抗原表位的重組PR8流感病毒嵌合疫苗，并觀測(cè)其免疫保護(hù)效果。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用冷適應(yīng)、減毒流感病毒株為載體，將腺病毒六鄰體保護(hù)性抗原表位重組到冷適應(yīng)、減毒流感病毒NA基因中，拯救表達(dá)腺病毒六鄰體保護(hù)性抗原表位的重組冷適應(yīng)、減毒流感病毒嵌合疫苗，并觀測(cè)其免疫原性及免疫保護(hù)效果。
　　本研究主要包括以下二部分內(nèi)容：

2、　　第一部分、以PR8流感病毒為載體的rFLU/HAdV/NS1-H疫苗候選株的初步研究
　　方法與結(jié)果：
　　1.應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)，以流感病毒PR8為載體，將HAdV六鄰體蛋白抗原表位的基因插入流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS基因中，構(gòu)建重組質(zhì)粒NS1-Hexon，將重組質(zhì)粒與PR8流感病毒其他7個(gè)基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS1-MDCK共培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)HA、RT-PCR、間接免疫熒光（IFA）、WB、電鏡等方法證明拯救出的重組病毒為rF

3、LU/HAdV/NS1-H疫苗株。
　　2.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株接種雞胚擴(kuò)增、30％-60%蔗糖密度梯度純化，測(cè)定其血凝效價(jià)為215，每1mL rFLU/HAdV/NS1-H病毒液含有1×106.5TCID50單位，其抗原蛋白含量為6.15mg/mL。
　　3.選用6周齡的雌性BALB/c小鼠，接種rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立104TCID50和105TCID50兩個(gè)劑量組，并用0.

4、01M PBS為對(duì)照組。小鼠按20μL/只劑量進(jìn)行滴鼻免疫，0、28天，免疫兩次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細(xì)胞懸液。應(yīng)用微量中和法、ELISA法測(cè)定免疫小鼠血清針對(duì)PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗體效價(jià)以及針對(duì)HAdV-3的抗體亞型IgG、IgG1和IgG2a滴度；應(yīng)用ELISPOT法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液針對(duì)PR8流感病毒和HAdV-3細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平；應(yīng)用ELISA法測(cè)定小鼠

5、肺鼻灌洗液針對(duì)HAdV-3特異性的sIgA抗體效價(jià)。結(jié)果表明，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對(duì)PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗體，產(chǎn)生針對(duì)HAdV-3的體液免疫、細(xì)胞免疫及粘膜免疫反應(yīng)，與PBS對(duì)照組比較差異顯著（p<0.05或p<0.01）。同時(shí)，105TCID50劑量組免疫效果優(yōu)于104TCID50劑量組。
　　4.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，A/PR/8/

6、34(H1N1)流感病毒和HAdV-3病毒進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株能夠明顯減輕PR8流感病毒和HAdV-3病毒感染后癥狀、有效降低肺鼻的病毒載量、顯著改善肺組織的病理病變情況，保護(hù)小鼠抵抗PR8流感病毒的致死性攻擊。
　　結(jié)論：
　　成功拯救rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株，其能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較好的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫效應(yīng)。rFLU/HAdV/NS1-H免疫的小鼠對(duì)HAdV-3

7、攻毒具有較好的保護(hù)效果。
　　第二、以冷適應(yīng)減毒A/California/07/2009流感病毒為載體的rFLU/HAdV/NA-H減毒疫苗候選株的初步研究
　　方法與結(jié)果：
　　1.將驗(yàn)證的HAdV六鄰體蛋白的抗原表位基因插入A/California/07/2009流感病毒表面基因NA特定位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒NA-Hexon，以A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)型流感病毒為骨架病毒，將其6個(gè)內(nèi)部基因(P

8、B1、PB2、PA、NP、M、NS)與A/California/07/2009流感病毒HA基因及重組質(zhì)粒NA-Hexon構(gòu)建到雙向表達(dá)載體pAD3000上，共轉(zhuǎn)染COS1-MDCK共培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)HA、RT-PCR、WB、電鏡等方法證明拯救出的重組病毒為rFLU/HAdV/NA-H疫苗株。
　　2.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株接種雞胚擴(kuò)增，經(jīng)30%-60%蔗糖密度梯度純化，測(cè)定其血凝效價(jià)為216，每1mL rFLU/HAdV/

9、NA-H病毒液含有1×107TCID50單位，其抗原蛋白含量為7.32mg/mL。
　　3.6周齡的雌性BALB/c小鼠，接種rFLU/HAdV/NA-H疫苗株為實(shí)驗(yàn)組（設(shè)立105TCID50和106TCID50兩個(gè)劑量組），并用0.01M PBS為對(duì)照組。小鼠按20μL/只劑量進(jìn)行滴鼻免疫，0、28天，免疫兩次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細(xì)胞懸液。應(yīng)用微量中和法、ELISA法測(cè)定免疫小鼠血清針對(duì)B

10、J501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗體效價(jià)以及針對(duì)HAdV-3和HAdV-7的抗體亞型IgG、IgG1和IgG2a滴度；應(yīng)用ELISPOT法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液針對(duì)BJ501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平；應(yīng)用ELISA法測(cè)定小鼠肺鼻灌洗液中針對(duì)HAdV-3和HAdV-7特異性的sIgA抗體效價(jià)。結(jié)果表明，rFLU/HAdV/NA-H疫苗株在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對(duì)BJ501流

11、感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗體，產(chǎn)生針對(duì)HAdV-3和HAdV-7的體液免疫、細(xì)胞免疫及粘膜免疫反應(yīng)，與PBS對(duì)照組比較差異顯著（p<0.05或p<0.01）。同時(shí)，106TCID50劑量組免疫效果優(yōu)于105TCID50劑量組。
　　4.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，選用BJ501(H1N1)流感病毒和HAdV-3、HAdV-7病毒進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，rFLU/HAdV/NA-