負(fù)載布魯菌WboA-S2株對骨髓源性肥大細(xì)胞的活化作用的體外研究.pdf

1、目的：
　　探討B(tài)MMC對布魯菌的識別機制及應(yīng)答效應(yīng)以及WboA基因在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用，為研發(fā)以WboA-S2株為靶抗原的新型布魯菌疫苗和布魯菌病的防治提供實驗依據(jù)和研究新思路。
　　方法：
　　1.采用IL-3和SCF體外誘導(dǎo)的方法制備BMMC；根據(jù)BMMC培養(yǎng)狀態(tài)及甲苯胺藍染色對BMMC進行鑒定；
　　2.分別用布魯菌WboA-S2株和S2株按感染復(fù)數(shù)（MOI）100:1負(fù)載BMMC，并以正常B

2、MMC為對照，負(fù)載15min，30min，45min，60min后分別進行甲苯胺藍染色和瑞氏-吉姆薩染色，觀察負(fù)載不同菌種后的不同時間點BMMC的形態(tài)學(xué)變化，以觀察布魯菌對BMMC的活化效應(yīng)及WboA基因產(chǎn)物在活化肥大細(xì)胞中的作用；
　　3.以FITC標(biāo)記的布魯菌WboA-S2株、S2株負(fù)載BMMC后激光共聚焦顯微鏡觀察BMMC對布魯菌WboA-S2株和S2株的攝取狀態(tài)；
　　4.分別用布魯菌WboA-S2株和S2株按感染復(fù)

3、數(shù)（MOI）100:1負(fù)載BMMC，并以正常BMMC為對照，負(fù)載3h，6h，12h，24h后用ELISA法檢測上清中TNF-α，IFN-γ，組胺，IL-1，IL-6，IL-12的含量，以觀察負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后BMMC釋放生物活性介質(zhì)的情況；
　　5. RT-PCR法檢測正常BMMC的TLR2、4、8與9 mRNA的表達；
　　6.分別用布魯菌WboA-S2株和S2株按感染復(fù)數(shù)（MOI）100:1負(fù)載BMMC

4、，并以正常BMMC為對照，負(fù)載12h，24h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR法觀察BMMC載菌后不同時間點TLR2，TLR4，TLR8和TLR9 mRNA表達的變化；
　　7.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測BMMC負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后12h TLR4和TLR8蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后BMMC的形態(tài)學(xué)變化
　?。?）甲苯胺藍染色后光學(xué)顯微鏡下觀察：正常BMMC內(nèi)有很多顆

5、粒；負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后15min，兩組BMMC即發(fā)生明顯的脫顆粒；隨著負(fù)載時間的延長，BMMC內(nèi)的顆粒逐漸減少，至負(fù)載后60min，BMMC胞質(zhì)內(nèi)幾乎無顆粒存在，且WboA-S2株負(fù)載組較S2株負(fù)載組脫顆粒更明顯。
　?。?）瑞氏-吉姆薩染色后光學(xué)顯微鏡下觀察：負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后15min，兩組BMMC體積均開始增大；負(fù)載后30min，BMMC胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)中開始出現(xiàn)空泡，但兩組胞膜均完整；負(fù)

6、載后45min，BMMC胞質(zhì)中空泡明顯增多增大，胞膜出現(xiàn)泡沫化；負(fù)載后60min，BMMC胞質(zhì)中幾乎全是空泡，WboA-S2株負(fù)載組的BMMC細(xì)胞膜較S2株負(fù)載組較完整。
　　（3）激光共聚焦檢測結(jié)果：BMMC負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株1h時，WboA-S2株和S2株均位于BMMC胞膜上，說明布魯菌并未被攝入到肥大細(xì)胞內(nèi)，而是粘附在細(xì)胞膜表面。
　　2.布魯菌WboA-S2株和S2株對BMMC的激活作用
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7、1）BMMC負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后，兩組在各個時間點上清中TNF-α的含量均明顯高于正常對照組（P<0.05），但S2株負(fù)載組在各個時間點之間TNF-α的含量無明顯差異，而WboA-S2株負(fù)載組隨著時間的延長，TNF-α的含量逐漸增加，至12h時達到高峰，24h時開始下降，且WboA-S2株負(fù)載組在各個時間點上清中TNF-α的含量均明顯高于S2株負(fù)載組；
　?。?）BMMC負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后，S2株

8、負(fù)載組上清中IL-6的含量與正常對照組相比無顯著差異（P>0.05），而WboA-S2株負(fù)載組顯著高于同一時間點S2株負(fù)載組以及正常對照組（P<0.01），且隨著負(fù)載時間的延長，IL-6的含量有增加趨勢，至12h達高峰，24h時又開始下降。
　?。?）BMMC負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株后，兩組在各個時間點上清中組胺的含量均明顯高于正常對照組（P<0.05），隨著負(fù)載時間的延長，S2株負(fù)載組上清中組胺的含量呈增加趨勢，而Wb

9、oA-S2株負(fù)載組各個時間點之間無明顯變化。而且，負(fù)載24h時，S2株負(fù)載組明顯高于WboA-S2株負(fù)載組（P<0.05）。
　?。?）在布魯菌WboA-S2株負(fù)載組和S2株負(fù)載組各個時間點的上清中均未檢測到IFN-γ，IL-1，IL-12。
　　3. BMMC對布魯菌WboA-S2株和S2株的識別機制
　　（1）正常小鼠BMMC在mRNA水平表達TLR2，4和8，不表達TLR9。
　?。?）負(fù)載布魯菌WboA-

10、S2株和S2株的BMMC在12h，24h TLR4都有明顯變化，兩組TLR4在負(fù)載12h時的表達均明顯高于正常對照組，但WboA-S2株負(fù)載組的BMMC TLR4 mRNA的表達明顯高于S2株負(fù)載組，24h時兩組表達均明顯減少。
　?。?）S2株負(fù)載組在12h時TLR8 mRNA的表達有上升趨勢，但與正常對照組相比無明顯變化，而WboA-S2株負(fù)載組的TLR8表達明顯高于正常對照組，24h時兩組TLR8的表達均減少。
　　（

11、4）負(fù)載布魯菌WboA-S2株和S2株的BMMC，在12h，24h TLR2的表達量均沒有明顯變化。
　　（5）正常小鼠BMMC在蛋白水平表達TLR4和TLR8。
　?。?）WboA-S2株負(fù)載組和S2株負(fù)載組12h TLR4蛋白的表達均顯著高于正常對照組；S2株負(fù)載組在12h TLR8蛋白的表達與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，而WboA-S2株負(fù)載組12h TLR8蛋白的表達顯著高于正常對照組。
　　結(jié)論：