NEDD8介導(dǎo)的neddylation修飾的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖和蛻膜化中的作用研究.pdf

1、背景:
　　人的子宮內(nèi)膜是一個激素響應(yīng)的組織，這個組織在循環(huán)的月經(jīng)周期中有序地增殖、分化、脫落和修復(fù)。在每一個月經(jīng)周期中，這個動態(tài)的組織重塑為著床提供一個很短的容受期，這個時期被稱為“著床窗”。子宮內(nèi)膜的一個重要功能是允許胚胎粘附、浸潤、誘導(dǎo)基質(zhì)進入蛻膜化。如果著床失敗，內(nèi)膜將會退化，并隨著月經(jīng)周期而重塑和修復(fù)，為下一次的著床窗做準備。當(dāng)囊胚植入著床點后，著床囊胚陷入子宮內(nèi)膜的基質(zhì)床里，然后經(jīng)過大量分化，血管重塑和免疫細胞的募集，

2、這個過程叫做蛻膜化，是成功著床非常重要的過程。蛻膜組織產(chǎn)生大量分泌因子，在胎盤形成前為發(fā)育中的胚胎提供營養(yǎng)并且為胚胎提供了一個免疫耐受的環(huán)境。很多研究都證實子宮基質(zhì)增殖和分化的異常與臨床上的反復(fù)流產(chǎn)、先兆子癇、宮內(nèi)生長受限和不明原因性不孕密切相關(guān)。盡管有很多信號分子被證實參與調(diào)節(jié)內(nèi)膜重塑和和著床的變化過程，但是在月經(jīng)周期和妊娠早期調(diào)節(jié)正常內(nèi)膜功能的分子機制仍然有待進一步研究。
　　泛素化是泛素介導(dǎo)的降解蛋白的過程，但目前越來越多的

3、研究表明泛素化還有介導(dǎo)非蛋白降解的功能，包括DNA損傷修復(fù)、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胞吞作用和蛋白激酶活化等。也有更多的證據(jù)表明泛素化和許多組織器官的發(fā)育和疾病有關(guān)。在這方面，以前的研究提示泛素和泛素相關(guān)的蛋白在內(nèi)膜的轉(zhuǎn)換和胎盤的發(fā)育中很可能有重要的作用。例如非孕期的內(nèi)膜基質(zhì)細胞的泛素含量很低，但是早孕的時候蛻膜基質(zhì)的胞核和胞漿的泛素水平明顯升高。還有研究證明，體外培養(yǎng)的人子宮蛻膜細胞可以分泌泛素。雖然已有很多證據(jù)證明泛素和泛素相關(guān)蛋白介導(dǎo)

4、的泛素化與早孕期子宮內(nèi)膜的功能密切相關(guān)，但是具體的調(diào)節(jié)機制依然未闡明。
　　NEDD8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated8)是一個76氨基酸的多肽，它可以連接目的蛋白進行類泛素化的修飾，最初的報道是在小鼠胚胎的腦組織中高度富集。在許多類泛素的蛋白中，NEDD8與泛素最類似，并且可以通過一個活性的neddylation的過程，這個過程和泛素化非

5、常類似。NEDD8特異性地與底物蛋白相結(jié)合的修飾過程被稱為neddylation，這個過程需要的一系列的酶催化級聯(lián)反應(yīng)，參與的酶和泛素系統(tǒng)的很類似。這些酶包括NEDD8活化酶E1，它是由APPBP1和UBA3形成的異源二聚體，還有NEDD8結(jié)合酶E2(Ubc12)和可特異性選擇底物的NEDD3連接酶E3。與經(jīng)典的泛素化過程類似，neddylation的過程也包括連接、激活和與底物結(jié)合的有序過程。但是將NEDD8結(jié)合到底物蛋白的neddy

6、lation不是為了蛋白降解，而是改變蛋白的修飾以改變其活性和功能。neddylation過程最著名的底物蛋白是高度保守的cullin家族，cullin蛋白可以組成泛素E3連接酶的骨架結(jié)構(gòu)，Cullin是SCF(SKPl-Cullins-F-box proteins)復(fù)合體或SCF類E3連接酶CRL(Cullin-RINGubiquitin ligases)的重要組成分子。這些泛素連接酶的聚合需要cullin neddylation的激

7、活。所以通過調(diào)節(jié)CRLs，neddylation可以調(diào)節(jié)許多生理過程，包括胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的細胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。Cullins證實在孕早期母胎界面有表達，所以我們對于進一步研究NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜的增殖和分化中的生理功能有極大的興趣。
　　在本研究中，我們觀察到NEDD8在子宮內(nèi)膜中隨著月經(jīng)周期廣泛而持久第表達，并且通過使用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(T-HESC)和特異性的NEDD8激活酶抑制劑M

8、LN4924，進一步揭示了抑制neddylation可以導(dǎo)致增殖和分化的異常的機制，這些結(jié)果都為NEDD8介導(dǎo)neddylation對子宮內(nèi)膜基質(zhì)的增殖和分化的必要性提供了新的依據(jù)。
　　目的:
　　我們通過研究NEDD8在人子宮內(nèi)膜和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(HESC)中的表達和相關(guān)作用，探討NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜基質(zhì)的增殖和蛻膜化中的作用，為進一步研究NEDD8在圍著床期子宮內(nèi)膜容受性中的作用提供一定

9、的理論依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1、研究對象
　　收集從2013年1月到2013年5月間就診于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的患者共53例?；颊咴陆?jīng)周期規(guī)律，有排卵，無其它生殖系統(tǒng)疾病。收集從增殖早期到分泌晚期的人子宮內(nèi)膜組織，分別為增殖早期（10例）、增殖晚期（13例）、分泌早期（10例）、分泌中期（10例）和分泌晚期（10例）。3例增殖晚期內(nèi)膜組織用于提取原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，剩余50例組織用于提取RNA和

10、免疫組織化學(xué)染色觀察NEDD8在人子宮內(nèi)膜月經(jīng)周期的不同時期的表達模式。用永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(T-HESC)分別在增殖和MPA/cAMP誘導(dǎo)的分化狀態(tài)下觀察NEDD8的表達和相關(guān)作用研究。
　　2、研究方法
　　用NEDD8激活酶特異性抑制劑MLN4924抑制neddylation，分別觀察HESC增殖和分化的異常。首先用MTS和Ki67檢測細胞增殖，用流式細胞術(shù)分選細胞周期，然后用BrdU和pH3分別標記細胞周期

11、的S期和G2/M期。用F-actin首先檢測分化狀態(tài)下細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)，然后在HESC中抑制neddylation后檢測分化的標志分子PRL、IGFBP1和STAT3的mRNA水平。在明確抑制neddylation會影響HESC的蛻膜化后，我們用蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)p21的異常積聚?？紤]p21是衰老相關(guān)的分子，我們用SA-β-Gal染色標記細胞衰老的數(shù)目。最后用p21的特異性siRNA降低異常升高的p21水平，看是否能挽救增殖和分化的異

12、常以進一步研究機制。
　　3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)均以x±s表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。多因素資料采用析因設(shè)計方差分析（two-way ANOVA）。兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;多組均數(shù)方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較;多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計分析中，檢驗標準為α=0.05。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

13、。所有實驗除特殊說明外至少重復(fù)3次。
　　結(jié)果:
　　1.NEDD8在子宮內(nèi)膜的基質(zhì)和上皮中廣泛表達，從增殖早期到分泌晚期的腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細胞中均有表達。這種強烈而持久的表達和核定位的表達模式提示NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜的增殖和分化中可能有重要作用，很有可能參與其動態(tài)的調(diào)節(jié)過程。
　　2.NEDD8在永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(T-HESC)中的增殖期和分泌期均有表達，而且與免疫組化染色

14、結(jié)果一樣都呈核定位，提示NEDD8在內(nèi)膜基質(zhì)中發(fā)揮一定的作用，并且用這個細胞系進行基質(zhì)相關(guān)的下一步研究是可行的。
　　3.NEDD8激活酶特異性抑制劑MLN4924可以有效抑制cullin neddylation，并且導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的異常。細胞周期的異常是造成增殖異常的一部分原因，在異常的細胞周期中，抑制neddylation表現(xiàn)為細胞進入S期減少和減緩，并且不進入G2/M期。提示MLN4924抑制neddylatio

15、n是通過影響細胞周期部分影響HESC的增殖。
　　4.MLN4924抑制neddylation還可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞分化的異常。表現(xiàn)為細胞微絲骨架的異常，并且使細胞無法進入蛻膜化。
　　5.MLN4924抑制neddylation導(dǎo)致p21水平的異常積聚，由于p21是誘導(dǎo)細胞衰老的分子，所以我們進一步檢測了細胞衰老，結(jié)果提示增殖和分化狀態(tài)的HESC中p21增加會使細胞衰老增加，這個結(jié)果提示p21的升高可能影響細胞活性從

16、而導(dǎo)致細胞衰老的增加。同時p21是細胞周期中抑制G1期向S期和S期向G2/M期進行的分子，所以異常升高的p21可能通過抑制細胞周期影響細胞的增殖。
　　6.在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(HESC)中用MLN4924抑制neddylation不會導(dǎo)致細胞凋亡，與時間和劑量均不相關(guān)，說明細胞增殖的異常不是由于細胞凋亡造成的。
　　7.用p21特異性siRNA降低異常升高的p21的水平可以部分挽救增殖的異常和細胞衰老的增加，但是不能挽救

17、分化的異常。說明增殖的異常部分是由于p21的升高引起的（細胞周期的阻滯和細胞衰老的增加），但是分化的異常有其他機制，有待我們進一步研究。
　　結(jié)論:
　　1.NEDD8在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)中隨著月經(jīng)周期穩(wěn)定而持久地表達。
　　2.NEDD8在永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(T-HESC)中增殖期和分化期均有表達。
　　3.MLN4924抑制neddylation可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的異常。細胞周期的異常的部分

18、原因，表現(xiàn)為進入S期減少和減緩，并且不進入G2/M期。
　　4.MLN4924抑制neddylation可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞分化的異常，表現(xiàn)為細胞微絲骨架的異常和細胞無法進入蛻膜化。
　　5.MLN4924抑制neddylation導(dǎo)致p21水平的異常積聚，同時誘導(dǎo)細胞衰老的增加。
　　6.在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系(HESC)中抑制neddylation不會導(dǎo)致細胞凋亡。
　　7.降低異常升高的p21水平可以