類泛素蛋白NEDD8賴氨酸功能研究和修飾底物鑒定.pdf

1、背景和目的：
　　泛素樣蛋白NEDD8（Neural-precursor-cell-Expressed Developmentally Down-regulated8）是最重要的類泛素化蛋白之一，其與底物蛋白的結(jié)合過程稱為neddylation。Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等高度相關(guān)。泛素的7個賴氨酸可以形成不同的泛素鏈結(jié)構(gòu)，在各種生化過程中發(fā)揮著重要的作用。然而NEDD8上不同賴氨酸的功能至今尚未被

2、研究。本課題中，我們將NEDD8中的各個賴氨酸分別突變成精氨酸，從而獲得9個NEDD8突變體，研究了NEDD8上賴氨酸的潛在功能。作為E3泛素連接酶的一個組成蛋白，cullins是最早被發(fā)現(xiàn)可被NEDD8修飾的底物蛋白，cullins的neddylation修飾可以激活cullin-RING E3（CRL E3）泛素連接酶的活性。相比泛素修飾的底物蛋白研究，NEDD8修飾底物蛋白的研究少之又少。本課題中，我們通過親和層析方法來分離富集N

3、EDD8修飾的底物蛋白，并用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　構(gòu)建將各個賴氨酸分別突變成精氨酸的9個NEDD8突變體，在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá) NEDD8野生型和突變體，免疫印跡在全蛋白液中檢測各個突變體對neddylation修飾的影響，找到關(guān)鍵賴氨酸；共轉(zhuǎn)染NEDD8野生型、突變體與NEDD8激活酶NAE1/Uba3、結(jié)合酶UBE2M，免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對NEDD8的激活、結(jié)合過程的影響；共轉(zhuǎn)染NEDD8野生

4、型、突變體與 cullins家族蛋白，純化cullins后免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對底物蛋白neddylation修飾及泛素修飾的影響；共轉(zhuǎn)染NEDD8野生型、突變體與cullins家族成員與CRL E3泛素連接酶底物，純化CRL E3泛素連接酶底物后免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對底物蛋白泛素化的影響；大量過表達(dá)帶His6親和標(biāo)簽的NEDD8，通過標(biāo)簽親和純化NEDD8修飾蛋白，胰蛋白酶酶解后獲得多肽片段，用質(zhì)譜分析獲得其底物蛋白。

5、
　　結(jié)果：
　　（1）K27R NEDD8突變體抑制了蛋白質(zhì)neddylation修飾。
　?。?）K27R NEDD8未影響NEDD8的激活過程。
　?。?）K27R NEDD8突變體通過與NEDD8結(jié)合酶UBE2M形成穩(wěn)定的共價鍵，影響了NEDD8的結(jié)合過程。
　　（4）K27R NEDD8突變體影響了cullins的neddylation修飾。
　?。?）K27R NEDD8突變體也影響了cu

6、llins的泛素化修飾。
　?。?）K27R NEDD8突變體大大降低了cullin RING E3泛素連接酶底物IB的泛素化修飾。
　?。?）質(zhì)譜分析共鑒定了84種NEDD8修飾蛋白，其中67種是新鑒定到的潛在NEDD8修飾底物蛋白，如染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白RCC等蛋白。
　　結(jié)論：
　　我們在NEDD8中發(fā)現(xiàn)了一個影響底物蛋白neddylation修飾的賴氨酸。NEDD8第27位賴氨酸的突變可以抑制neddyla

7、tion修飾。其作用機制為K27R NEDD8突變體與結(jié)合酶UBE2M形成了某種穩(wěn)定的共價鍵，從而無法與UBE2M形成硫酯鍵，進(jìn)而阻斷neddylation的下游進(jìn)程。K27R NEDD8突變體可以抑制cullins的neddylation修飾與泛素化修飾，從而影響了cullins相關(guān)的E3泛素連接酶的活性及其底物蛋白質(zhì)的泛素化。K27R NEDD8突變體在研究蛋白質(zhì)neddylation修飾的生化功能中可以作為重要的顯性負(fù)性突變體；N