基于CMCS-PEI雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體的制備和評(píng)價(jià).pdf

1、納米技術(shù)在共遞送化療藥物和基因治療惡性腫瘤中顯示良好的應(yīng)用前景，改善了藥物遞送過(guò)程中穩(wěn)定性低、溶解度小、選擇性差等問(wèn)題。然而有效推動(dòng)共遞送基因和化療藥物納米載體走向臨床仍需不斷努力。pH敏感共遞送藥物和基因納米載體以其可控釋藥的優(yōu)勢(shì)成為近年研究熱點(diǎn)。pH敏感共遞送抗癌藥和基因納米載體可簡(jiǎn)單利用腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體酸性環(huán)境實(shí)現(xiàn)藥物和基因可控遞送，從而降低毒副作用并提高治療效果。腫瘤微環(huán)境pH敏感共遞送化療藥物和基因納米載體在血液循環(huán)

2、中穩(wěn)定存在，到達(dá)酸性腫瘤組織后，外殼pH敏感性脫落，暴露功能化內(nèi)核并被腫瘤細(xì)胞攝取，增加胞內(nèi)有效藥物濃度，提高抗腫瘤效果;內(nèi)吞體/溶酶體pH敏感納米載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞體/溶酶體后，在酸性pH誘導(dǎo)下可迅速釋放藥物，到達(dá)胞內(nèi)可控釋藥目的。然而，隨著研究不斷深入，更為精確控制藥物釋放以及增加胞內(nèi)有效藥物濃度問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。利用腫瘤微環(huán)境pH(6.0～7.0)低于正常組織pH(7.4)，內(nèi)吞體/溶酶體pH(4.5～6.5)低于胞漿pH(7.4)

3、，設(shè)計(jì)一種在腫瘤微環(huán)境和溶酶體/內(nèi)吞體酸性環(huán)境中程序性響應(yīng)地雙pH敏感共遞送藥物和基因納米載體可實(shí)現(xiàn)藥物和基因更為精確控制釋放并增加胞內(nèi)有效藥物濃度。
　　本課題采用功能集成組裝技術(shù)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體，以期實(shí)現(xiàn)化療藥物和基因更為可控地遞送。選取目前最為有效的聚陽(yáng)離子基因載體聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為內(nèi)核材料共遞送化療藥物DOX和基因。采用內(nèi)吞體/溶酶

4、體pH響應(yīng)性裂解腙鍵連接DOX和PEI，合成了胞內(nèi)pH敏感載藥材料DOX-PEI(DP)。O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl-chitosan，CMCS)生物相容性良好，且CMCS在pH高于7.0時(shí)荷負(fù)電而在pH低于6.5時(shí)荷正電。基于此，合成了以NGR為靶向因子的腫瘤微環(huán)境pH敏感材料CMCS-PEG-NGR(CPN)?；谝陨瞎δ芑疍P和CPN，可組裝腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN

5、/DP/pDNA(CPN/DPD，CDPD)。DP作為一種陽(yáng)離子聚合物，可有效壓縮荷負(fù)電的pDNA分子形成DP/pDNA復(fù)合物(DPD)，實(shí)現(xiàn)藥物和基因的共同裝載。制備的內(nèi)吞體/溶酶體pH敏感共遞送DOX和pDNA納米載藥DPD，DPD內(nèi)核表面帶正電荷，在生理?xiàng)l件下(pH7.4)吸附荷負(fù)電CPN，形成腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/DPD(CDPD)。CDPD經(jīng)給藥后將在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，到達(dá)腫瘤

6、部位后，NGR介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用在腫瘤組織蓄積。腫瘤微環(huán)境pH誘導(dǎo)CPN由負(fù)電荷逆轉(zhuǎn)為正電荷并從CDPD表面脫落（第一重pH敏感），暴露DPD內(nèi)核。DPD表面正電荷可有效促進(jìn)細(xì)胞攝取作用，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的DPD輸送到內(nèi)吞體/溶酶體，經(jīng)內(nèi)吞體/溶酶體酸性pH誘導(dǎo)，腙鍵斷裂并迅速釋放DOX（第二重pH敏感），由于PEI“質(zhì)子海綿”效應(yīng)產(chǎn)生溶酶體逃逸作用，PEI/pDNA和DOX釋放進(jìn)入胞漿，并發(fā)揮相應(yīng)抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)中以編碼綠色熒光蛋白的pDNA

7、為模型基因，考察CDPD在模擬腫瘤微環(huán)境pH和內(nèi)吞體/溶酶體pH條件下CPN響應(yīng)性脫落以及DOX和pDNA程序釋放。探究CDPD作為腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體可能性，為進(jìn)一步抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步探究腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢(shì)并提高胞內(nèi)有效藥物和基因濃度，提高癌癥治療效果。利用TAT肽作為一種經(jīng)典陽(yáng)離子細(xì)胞穿透肽，以PEG共同連接TAT和PEI

8、，合成了具有促進(jìn)穿細(xì)胞膜作用材料PEI-PEG-TAT(PPT)。同時(shí)選定腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體質(zhì)粒(plasmid tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands，pTRAIL)為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮制備胞內(nèi)pH敏感的促細(xì)胞攝取PPT/DP/pTRAIL(PDT)，制備的PDT內(nèi)核包裹CPN后形成腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞雙促進(jìn)的腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體

9、雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/PDT(CPDT)。以期待制備的CPDT除具有腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感特性實(shí)現(xiàn)更為可控藥物和基因釋放外，到達(dá)腫瘤組織后由于NGR介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用在腫瘤部位蓄積（第一重促進(jìn)作用），腫瘤組織pH誘導(dǎo)CPN脫落后暴露的PDT內(nèi)核由于TAT介導(dǎo)穿細(xì)胞膜（第二重促進(jìn)作用），增加胞內(nèi)有效藥物和基因濃度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)PPT促進(jìn)細(xì)胞攝取PDT能力進(jìn)行考察并確定最優(yōu)處方，對(duì)PDT體外抗增殖作用進(jìn)行考察

10、，同時(shí)采用Western Blot分析TRAIL蛋白表達(dá)。為雙pH敏感共遞送載體進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本課題主要研究腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體作為共遞送載體可能性以及腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體共遞送化療藥物DOX和治療基因pTRAIL體外抗腫瘤效果。為腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，本課題主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1 DO

11、X含量測(cè)定方法學(xué)考察
　　采用紫外分光光度法測(cè)定DOX在pH5.0和pH7.4的PBS中含量，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明此方法簡(jiǎn)便快速且專屬性好，在pH5.0和pH7.4的PBS中，DOX濃度在0.05～100μg/mL范圍內(nèi)與吸光度(A)呈良好線性關(guān)系。精密度和回收率均符合規(guī)定。
　　2雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體構(gòu)建和評(píng)價(jià)
　　功能化材料的合成是腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載

12、體構(gòu)建的基礎(chǔ)。本課題合成DP和CPN，核磁圖譜驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。基于功能化DP和CPN，采用功能集成組裝技術(shù)構(gòu)建胞內(nèi)pH敏感DPD和腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感CDPD。選定DP/pDNA最優(yōu)質(zhì)量比為25∶4制備DPD，同時(shí)選定CPN/pDNA最優(yōu)質(zhì)量比為25∶8制備CDPD。DPD和CDPD外觀形態(tài)圓整，呈球形和類球形。DPD和CDPD平均粒徑分別為80.0±4.2 nm和137.4±2.7 nm，Zeta電位分別為23.59±2.5

13、9 mV和8.25±2.43 mV。體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在儲(chǔ)存條件下DPD比CDPD納米粒穩(wěn)定性好，DPD和CDPD納米粒在4℃條件下儲(chǔ)存一周后平均粒徑分別增加了約33.35 nm和83.02 nm，在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中CDPD比DPD穩(wěn)定性好，DPD和CDPD在37℃與含10％ FBS的DMEM孵育24 h后平均粒徑分別增加了約226.48 nm和36.6 nm。體外攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDPD納米在CD

14、13陽(yáng)性A549中攝取率(92.49±2.28％)要高于其在CD13陰性HepG2細(xì)胞中攝取率(67.82±0.07％，p＜0.05)。不同pH條件下體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值從7.4降低到6.0，CDPD在HepG2細(xì)胞上轉(zhuǎn)染效率逐漸增高，表明在模擬腫瘤微環(huán)境pH條件下(pH6.0)，CPN可從CDPD納米粒表面完全脫落。脫落CPN外殼的DPD內(nèi)核在模擬內(nèi)吞體/溶酶體環(huán)境中（0.1M的pH5.0PBS）孵育4h后，可完全釋放DOX并

15、保護(hù)pDNA免受破壞。共遞送實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDPD到達(dá)腫瘤部位后暴露DPD內(nèi)核并有效共遞送DOX和pDNA進(jìn)細(xì)胞。3雙促進(jìn)雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體的構(gòu)建和評(píng)價(jià)
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢(shì)，并提高胞內(nèi)有效藥物濃度，殺死腫瘤細(xì)胞。合成了促進(jìn)穿細(xì)胞膜PPT，并選定pTRAIL為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮pTRAIL制備腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞雙促進(jìn)的腫瘤微環(huán)境

16、和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體內(nèi)核PPT/DP/pTRAIL(PDT)。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPT、DP和C6-SANH-PEI材料具有相似的壓縮基因能力，均能夠在質(zhì)量比為25∶16時(shí)將pTRAIL完全壓縮。選定最優(yōu)處方為混合材料與pTRAIL質(zhì)量比為25∶4，混合材料中PPT占30％。制備的PDT外觀圓整，呈類球形，平均粒徑為80.29±3.66 nm。與游離DOX以及只載pTRAIL納米載體(P

17、PT/C6-SANH-PEI/pTRAIL，PCT)比較，PDT能夠顯著提高在HepG2和A549細(xì)胞上的體外抗腫瘤效果。同時(shí)Western Blot分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDT能夠很好地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提高蛋白表達(dá)量。因此制備的雙促進(jìn)雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體CPN/PDT(CPDT)具備腫瘤細(xì)胞內(nèi)外雙重敏感的同時(shí)，也具腫瘤部位和腫瘤細(xì)胞雙重促進(jìn)作用，因此CPDT除以一種更為可控的方式釋放藥物和基因，還可有效增加胞內(nèi)