美滿霉素在大鼠視神經(jīng)損傷再生中的作用研究及對AIF、GFAP表達的影響.pdf

1、目的:視神經(jīng)損傷是以視功能進行性下降為臨床特征的常見致盲性眼病，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，目前尚缺乏有效的治療藥物。視神經(jīng)是由神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的軸突構(gòu)成，而視神經(jīng)節(jié)細胞的死亡是各種視神經(jīng)損傷類疾病如青光眼、外傷性視神經(jīng)病變、顱內(nèi)占位疾病等視功能下降的共同根源，且研究表明視神經(jīng)損傷后RGCs死亡的重要方式是凋亡。故選擇能夠有效抑制視神經(jīng)損傷后RGCs凋亡并促進其再生修復(fù)的藥物是至關(guān)重要的。

2、美滿霉素(minocycline，MC)可通過抗凋亡、抗神經(jīng)膠質(zhì)細胞過度激活、抗神經(jīng)炎癥等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用，是一種有效的神經(jīng)細胞保護劑。然而美滿霉素針對視神經(jīng)損傷后的抗凋亡、抗膠質(zhì)細胞過度激活、促神經(jīng)修復(fù)等作用及機制目前尚未明確。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)是主要的凋亡效應(yīng)蛋白。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是神經(jīng)膠質(zhì)細胞

3、的標(biāo)志蛋白，可反應(yīng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)。
　　 本研究制造了大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型，實驗組通過給予腹腔注射美滿霉素與觀察組進行對比，取材后在光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的形態(tài)學(xué)改變，并利用計算機圖像分析技術(shù)對經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的視網(wǎng)膜組織中AIF、GFAP的平均光密度值(The average optical density value，AOD)進行半定量檢測，以觀察二者在視網(wǎng)膜組織中的表達情況。從而探討美滿霉素對損傷后視神經(jīng)的再生修復(fù)

4、作用及對視網(wǎng)膜組織中AIF、GFAP表達的影響，為其用于治療視神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法:健康SD大鼠80只（80只右眼）雌雄不限，體重200±20g，隨機分四組:正常組、假損傷組（僅暴露右眼視神經(jīng)）、實驗組（行右眼視神經(jīng)鉗夾傷+傷后即刻腹腔注射45mg/kg美滿霉素液，此后一次每日至觀察時間點）和對照組（行右眼視神經(jīng)鉗夾傷+傷后即刻腹腔注射等量生理鹽水，此后一次每日至觀察時間點），每組20只大鼠（20只右眼）。分別按傷

5、后1、3、7、14天四個時間點隨機取各組大鼠5只，進行心臟灌注固定，摘除右側(cè)眼球并剔除多余組織，后將視網(wǎng)膜組織固定切片。光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色后視網(wǎng)膜組織的形態(tài)學(xué)變化，觀察經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后視網(wǎng)膜組織中AIF、GFAP的表達變化。利用計算機圖像分析技術(shù)對經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后視網(wǎng)膜組織中AIF、GFAP的平均光密度值(AOD)進行半定量檢測。以免疫陽性染色的AOD來表示抗原表達量，AOD越高則陽性表達越強。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟

6、件包分析資料，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示（(又)±s）。同一時間點數(shù)據(jù)采用多樣本均數(shù)的單因素方差分析(One-way，ANOVA)，組間數(shù)據(jù)采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果
　　 正常組及假損傷組:視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰各時間點無明顯變化，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞呈條帶狀排列無水腫及壞死。對照組:隨著損傷時間延長大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)明顯水腫，可見空泡樣變性，

7、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列混亂、細胞核明顯丟失稀疏。實驗組:損傷早期視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較清晰，隨損傷時間的延長可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞水腫，但各時間點大鼠視網(wǎng)膜組織損傷程度均較對照組減輕，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列尚整齊，細胞核丟失程度較對照組輕。
　　 2、AIF、GFAP的免疫組織化學(xué)染色及半定量檢測結(jié)果
　　 2.1、AIF相關(guān)結(jié)果
　　 AIF的免疫強陽性染色呈棕褐色表達于細胞漿，部分可表達于胞核內(nèi)。正常組及假損傷組可見呈弱

8、陽性的淺黃染色，各時間點無明顯不同;對照組1d為弱陽性染色呈黃色，3d、7d呈持續(xù)性增強，7d達棕褐色，損傷14d染色明顯減弱接近1d時呈黃色;實驗組1d、3d、7d、14d均較對照組相應(yīng)時間點免疫染色弱。
　　 免疫組化的半定量檢測結(jié)果:正常組與假損傷組半定量檢測的平均光密度值(AOD)在各時間點上差別均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），正常組1d時AOD為0.165±0.047;對照組1d、3d、7d、14dAOD分別為0.19

9、3±0.046、0.328±0.034、0.517±0.065、0.264±0.039與正常組各時間點相比差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且對照組均高于正常組;實驗組1d、3d、7d、14dAOD分別為0.184±0.018、0.239±0.024、0.287±0.028、0.189±0.009與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且實驗組均高于正常組;對照組與實驗組相比各時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且實驗組各

10、時間點AOD均小于對照組。
　　 2.2、GFAP相關(guān)結(jié)果
　　 GFAP的免疫強陽性表達成棕色，可位于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜于外界膜之間各層。正常組及假損傷組可見呈弱陽性的淺黃染色，各時間點表達無明顯變化;對照組1d為弱陽性呈淺黃染色，3d染色加深，7d達呈高峰呈棕色，14d表達呈淺黃染色;實驗組除14d外表達均較對照組弱，實驗組14d時仍可達實驗組3d時表達水平強于對照組3d的表達，但3d、7d、14d仍明顯強于正常組。

11、>　　 免疫組化的半定量檢測結(jié)果:正常組與假損傷組半定量檢測平均光密度值(AOD)在各時間點上差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，正常組1d的AOD為0.178±0.085;對照組3d、7dAOD分別為0.328±0.034、0.484±0.025與正常組3d、7dAOD分別為0.168±0.013、0.182±0.085相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，兩時間點AOD對照組均大于正常組;實驗組3d、7d、14d的AOD分別為0.

12、272±0.034、0.342±0.046、0.259±0.039與對照組3d、7d、14d的AOD分別為0.328±0.034、0.484±0.025、0.194±0.025相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，實驗組AOD3d、7d時低于對照組、14d時高于對照組;3d、7d、14d實驗組的AOD與正常組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且實驗組均高于正常組。
　　 結(jié)論:
　　 1、應(yīng)用美滿霉素后視網(wǎng)膜組織