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文檔簡介
1、[目的]人類進入21世紀,感染性疾病仍然是危害人類健康的重要疾患,SARS等新發(fā)傳染病的暴發(fā)和流行構成了嚴重公共衛(wèi)生,社會和經(jīng)濟問題??焖佟㈧`敏、特異的檢測病原體是預防和控制新發(fā)傳染病暴發(fā)的重要保證。本文的研究目的是建立檢測SARS冠狀病毒、出血性大腸桿菌O157:H7、霍亂弧菌O139、炭疽芽孢桿菌等四種重要病原體的快速、特異的檢測方法,為臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測手段。 [內(nèi)容]S
2、ARS冠狀病毒酶聯(lián)免疫檢測方法的建立;SARS冠狀病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立;霍亂弧菌O139實時熒光PCR檢測方法的建立;大腸桿菌O157:H7實時熒光PCR檢測方法的建立;炭疽桿菌實時熒光PCR檢測方法的建立。 [方法]克隆表達SARS結構蛋白并應用蛋白芯片技術篩選特異抗原,在獲得特異抗原基礎上,進行SARS冠狀病毒雙抗原夾心法ELISA試劑的研制,并以SARS陽性和陰性血清作為企業(yè)質(zhì)控品對ELISA試劑進行
3、優(yōu)化。根據(jù)本室專利技術-復合探針熒光定量技術分析原理,以各病原體的特異基因為靶序列,設計合成引物和探針,對相應病原體進行實時熒光定量PCR檢測,并探討核酸提取方法、鎂離子濃度、退火溫度、探針濃度等因素對定量PCR結果的影響。 [結果]成功表達M、N、S等結構蛋白及其相應肽段,蛋白芯片篩選結果表明位于N蛋白C末端的N2蛋白的特異性最強,以該蛋白為抗原研制了雙抗原夾心ELISA試劑。試劑盒的cutoff值為0.15,檢測中檢所的特異
4、性標準品(20份陰性血清及18份陽性血清)均合格;檢測中檢所的靈敏度標準品,64倍稀釋后仍為陽性;三批試劑檢測的批內(nèi)、批間變異系數(shù)差異均小于5%。試劑盒臨床考核結果顯示,對442例臨床確診的SARS患者血清樣本的平均陽性檢出率為70%;對302份SARS康復患者隨訪血清樣本的陽性檢出率為76%;對2726例SARS陰性血清樣本的檢測僅出現(xiàn)2例假陽性反應。 SARS-CoV實時熒光RT-PCR定量檢測的最佳鎂離子濃度為4mmol/
5、L,退火溫度為55℃,退火時間為20s。該方法可檢出5拷貝體外轉(zhuǎn)錄RNA分子,可對濃度介于106copies/μl-101copies/μl之間的樣品進行準確定量,檢測20份陰性血清及20份健康志愿者漱口水結果均為陰性;多次重復檢測,Ct值的CV值小于2%。并建立了一種快速、高效的核酸提取方法-磁珠法,并具有操作簡便、成本低等優(yōu)點。對臨床確診的42份SARS病人血清和漱口水標本進行檢測,該方法的檢出率為79%,與熒光抗體檢測法的符合率為
6、70%。 霍亂弧菌O139實時熒光PCR定量檢測的擴增體系和擴增條件優(yōu)化結果:3%甲酰胺,Mg2+5mmol/L,引物0.5μmol/L,熒光探針200nmol/L,淬滅探針400nmol/L,退火溫度55℃,退火時間20s。確定以Chelex法提取細菌DNA。該法檢測85株陽性菌株均為陽性,78株非O139腸道菌均無響應;可檢測低至10拷貝的質(zhì)粒DNA分子及10CFU的O139霍亂菌;檢測質(zhì)粒DNA和O139霍亂菌的批間、批內(nèi)
7、變異系數(shù)均小于5%;可對濃度介于101-107CFU/ul間的樣品進行較為準確的定量。檢測人工模擬污染的湖水樣品,最低檢測限達100CFU/ml。對335份臨床標本進行檢測,共檢出133份為陽性,而常規(guī)細菌培養(yǎng)法,僅檢測出90份陽性。 大腸桿菌O157:H7實時熒光PCR定量檢測的最佳擴增體系和擴增條件與霍亂弧菌O139的基本一致。13株O157菌株經(jīng)該法檢測均為陽性,而78株非O157腸道菌均為陰性;可檢測低至1拷貝的質(zhì)粒DN
8、A和1CFU的細菌,并可對濃度介于100-106CFU/ul間的細菌進行定量;檢測質(zhì)粒DNA和細菌核酸的批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%。在模擬污染的牛奶中,最低可檢出1×103CFU/ml的細菌,在果汁和土壤中,最低可檢出1×104CFU/ml的細菌。 炭疽桿菌實時熒光PCR定量檢測的方法,檢測10株炭疽菌株均為陽性,10株其它菌株均無響應;可檢測低至1拷貝的質(zhì)粒DNA,1CFU的細菌及10CFU的芽孢;定量線性范圍為101-10
9、6CFU/ul;批間批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%。在模擬污染的鼻拭子中,最低可檢出1×103CFU/ml的芽孢,在模擬奶粉和面粉中,最低可檢出1×103CFU/ml/0.1g的細菌,而在模擬土壤中,可檢出1×104CFU/ml/0.1g的細菌。 [結論]所研制的冠狀病毒雙抗原夾心法ELISA試劑盒敏感性較高,重復性、特異性良好,可作為SARS確診的輔助診斷工具,對SARS疫情的預防和控制有指導意義。復合探針熒光定量PCR技術能夠快速準
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