基于鎖式探針的豆類四種重要植物病原細菌快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、隨著我國豆類種子進口量的飛速增長，種子攜帶檢疫性細菌風險日益加大，嚴重影響我國豆類產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)。本研究擬以豌豆細菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌、菜豆普通細菌性疫病菌和菜豆細菌性萎蔫病菌等4種重要植物原細菌作為靶標菌，首次集成創(chuàng)新利用瑣式探針和液相懸浮芯片兩項技術(shù)優(yōu)勢，研究搭建豆類重要植物病原細菌快速高通量核酸檢測技術(shù)平臺，以替代過去對單個細菌進行逐一檢測的傳統(tǒng)方法，大幅提高檢測效率，解決我國豆類種子進境過程種攜帶的外來有害生物入侵風險管理和預

2、防控制，以及快速通關(guān)等難題。本研究主要成果如下:
　　1)首次設計了豌豆細菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌、菜豆普通細菌性疫病菌和菜豆細菌性萎蔫病菌等4種重要病原細菌的鎖式探針，通過優(yōu)化連接反應、消化反應、滾環(huán)擴增反應體系條件，構(gòu)建了基于鎖式探針的豌豆細菌性疫病菌、菜豆細菌性萎蔫病菌和菜豆疫暈病菌等4種單重滾環(huán)擴增檢測體系，并評估其特異性和靈敏度。結(jié)果表明:4種單重滾環(huán)擴增檢測方法能夠分別特異地檢測對應的靶標菌，而其他陰性對照菌株均無法檢

3、出，有較高的特異性;其中豌豆細菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌和菜豆細菌性萎蔫病菌單重滾環(huán)擴增檢測靈敏度與常規(guī)PCR靈敏度持平,分別為600 fg/μL、600fg/μL和4.34pg/μL;而菜豆普通細菌性疫病菌單重滾環(huán)擴增靈敏度為38.3fg/μL，比常規(guī)PCR靈敏度高出1個數(shù)量級。
　　2)首次建立了豌豆細菌性疫病菌、菜豆細菌性萎蔫病菌、菜豆疫暈病菌和菜豆普通細菌性疫病菌等4重滾環(huán)擴增方法并結(jié)合液相懸浮芯片檢測技術(shù)，實現(xiàn)了在同一反應

4、體系中同時、快速檢測出4種細菌，評估其檢測體系的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。結(jié)果表明:該檢測體系能夠同時特異地檢測到4種或其中某幾種靶標菌，檢測豌豆細菌性疫病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為4.85pg/μL和1.6×104cfu/ml，檢測菜豆疫暈病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為874 fg/μL和1.5×103cfu/ml，檢測菜豆普通細菌性疫病菌DNA和菌懸液靈敏度分別為486fg/μ L和2.3×103cfu/ml，檢測菜豆細菌性萎蔫

5、病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為1.06pg/μL和1.1×104cfu/ml;組內(nèi)重復試驗變異系數(shù)小于7.2％，具有良好的重復性。
　　3)通過系列梯度濃度的純菌懸液混合健康種子浸泡液檢測試驗中，常規(guī)PCR僅能檢測到100倍菌懸液處理液的菜豆普通細菌性疫病菌，而其他稀釋倍數(shù)的處理以及其他靶標菌的處理液均無法被檢測出;而四重液相檢測可以在一個反應內(nèi)同時檢出100、101倍菌懸液處理液中的豌豆細菌性疫病菌、菜豆細菌性萎蔫病菌、菜豆疫