基于封閉式卡盒的現(xiàn)場(chǎng)傳染病病原體檢測(cè)系統(tǒng)的研制與應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，由于環(huán)境變化、自然災(zāi)害、物種多樣性變化等因素，導(dǎo)致各種病毒引起的傳染性疾病不斷爆發(fā)并重復(fù)性出現(xiàn)，如SARS病毒、H1N1、H7N9禽流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒以及這兩年來(lái)談之色變的埃博拉病毒，寨卡病毒等。而且隨著全球化進(jìn)程的加快以及傳染病病原體傳播途徑的多變性，使得這些傳染病的爆發(fā)不再是局部地域出現(xiàn)，更是在全球范圍內(nèi)迅速流行，給人類健康和社會(huì)帶來(lái)極大的危害。因此，對(duì)傳染性疾病的防控、診斷和治療已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的熱點(diǎn)和

2、重點(diǎn)。
　　然而傳統(tǒng)的傳染性病原體檢測(cè)方法大都只適用于實(shí)驗(yàn)室部署環(huán)境，具有檢測(cè)過(guò)程分散、繁瑣、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、對(duì)環(huán)境敏感等缺點(diǎn)，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)員的實(shí)驗(yàn)技能要求較高。這些弊端都大大限制了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)傳染病檢測(cè)中的應(yīng)用。傳染病病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)要求具有操作簡(jiǎn)單、成本低、便攜和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)，因此，急需尋找一種新的技術(shù)平臺(tái)以滿足傳染病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。
　　本論文首先利用3D打印技術(shù)，設(shè)計(jì)并制作了封閉式的檢測(cè)卡盒，在此基礎(chǔ)上研

3、發(fā)了全自動(dòng)的便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)，并對(duì)儀器進(jìn)行了各項(xiàng)性能測(cè)試及實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)傳染病的檢測(cè)，成功地完成了現(xiàn)場(chǎng)傳染病從樣本輸入到結(jié)果輸出的自動(dòng)化檢測(cè)過(guò)程。具體內(nèi)容包括:
　　1.基于3D打印技術(shù)的封閉式檢測(cè)卡盒的設(shè)計(jì)與制造
　　首先根據(jù)病原體核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程明確了封閉式卡盒的設(shè)計(jì)需求，提出了基于柔性滑片的封閉式卡盒結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部各功能模塊。整個(gè)設(shè)計(jì)與制造過(guò)程采用了高精度的3D打印技術(shù)及醫(yī)用級(jí)PC-ABS材料，共經(jīng)歷5個(gè)批次的快速迭代試制

4、過(guò)程，設(shè)計(jì)和優(yōu)化了卡盒7個(gè)特殊零件的結(jié)構(gòu)，組裝完成的卡盒尺寸為140 mm×90 mm×30 mm。其內(nèi)部集成移液模塊、樣本處理及檢測(cè)區(qū)域，樣本處理范圍為20～1000μL，可同時(shí)進(jìn)行1～6項(xiàng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。液體操作范圍為2～200μL，實(shí)測(cè)在10μL和100μL處的移液相對(duì)誤差分別為1.71％和0.76％，重復(fù)性CV值分別為2.3％和0.77％，均優(yōu)于國(guó)標(biāo)規(guī)定。同時(shí)，對(duì)卡盒內(nèi)的磁珠法核酸提取及PCR配制過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。最后，實(shí)驗(yàn)證

5、明了上游核酸提取試劑的揮發(fā)對(duì)于下游PCR檢測(cè)并未造成抑制影響，說(shuō)明了在封閉式卡盒內(nèi)進(jìn)行一體化核酸檢測(cè)是可行的。
　　2.基于封閉式卡盒的現(xiàn)場(chǎng)病原體檢測(cè)系統(tǒng)的研發(fā)
　　以封閉式卡盒為基礎(chǔ)，研發(fā)了與之配套的自動(dòng)化驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，其內(nèi)部由移液控制、磁分離加熱、熱循環(huán)、熒光采集及輔助電路等功能模塊組成。其中，移液控制模塊的最大操作量程為260μL，精度為0.118μL，內(nèi)含濾芯以防止交叉污染;磁分離加熱模塊采用傾斜式滑動(dòng)結(jié)構(gòu)，可程序化控制

6、磁富集的位置，且溫控精度為±0.5℃，可在2 min內(nèi)升至目標(biāo)溫度;熱循環(huán)模塊可提供3通道的PCR反應(yīng)條件，其升降溫速度分別為4.6℃/s及4.0℃/s，控制精度為±0.3℃;熒光采集模塊提供雙色熒光通道（FAM/SYBR Green和Texas Red波長(zhǎng)的范圍的），采用單色LED作為激發(fā)光源，波動(dòng)性小于1μW，單次熒光信號(hào)的采集在2.5s內(nèi)完成。儀器整體尺寸為270 mm×275 mm×250 mm，重量為6.5 kg。現(xiàn)場(chǎng)操作時(shí)僅

7、需將帶樣本的卡盒放入儀器中，并配置實(shí)驗(yàn)參數(shù)，則可自動(dòng)完成整個(gè)檢測(cè)流程。
　　3.現(xiàn)場(chǎng)病原體檢測(cè)系統(tǒng)的性能測(cè)試
　　首先使用百日咳病毒質(zhì)粒DNA進(jìn)行了核酸提取效率的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)和手工提取的效率分別為95.49％和84.33％;使用HBV質(zhì)粒DNA測(cè)試獲得了104copies/mL的提取限，說(shuō)明系統(tǒng)的樣本處理能力在效率和靈敏度方面均可滿足下游PCR檢測(cè)的需求。同時(shí)，分別使用E.coli及HBV病毒的真實(shí)臨床樣本進(jìn)行了核酸提取對(duì)

8、比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示采用本系統(tǒng)操作在產(chǎn)量上比手工操作分別高出6.6 ng/μL和0.93 ng/μL。通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得本系統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)孔間差異為0.023（CV值），檢測(cè)限為104 copies/mL。最后，使用本系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行20次陰性和陽(yáng)性樣本的間隔實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果與預(yù)期一致，表明系統(tǒng)沒(méi)有發(fā)生批間交叉污染的現(xiàn)象。
　　4.現(xiàn)場(chǎng)傳染病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　在江蘇省疾病防控中心進(jìn)行了腺病毒的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并采用羅氏LightCycle

9、r2.0熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照，獲得未知樣本的Ct值分別為31.15和31.68，陽(yáng)參的Ct值分別為27.52和28.01，從擴(kuò)增曲線形態(tài)和Ct值的比較說(shuō)明兩系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果較為一致。最后，使用本卡盒系統(tǒng)對(duì)沙門氏菌及志賀氏菌進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，并設(shè)置卡盒內(nèi)采用懸滴加樣的方式進(jìn)行PCR體系的配置，同時(shí)采用ABISteponePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照。兩系統(tǒng)的擴(kuò)增曲線形態(tài)一致，兩路熒光檢測(cè)(FAM and Texas Red