IGF1Rα的真核表達及其對肝癌細胞HepG2細胞株免疫治療作用的體外研究.pdf

1、背景與目的：原發(fā)性肝細胞肝癌是一種常見的惡性腫瘤，適合手術治療的患者只占一少部分，具有較高的復發(fā)率，預后很差，嚴重威脅著人類的健康。人類腫瘤相關性抗原以及腫瘤抗原基因的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療尤其是主動性免疫治療提供了新的手段。直接作用于腫瘤特異性抗原或相關抗原的預防性瘤苗是目前研究的熱點。胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF1R）在各種腫瘤細胞中高水平表達，尤其是在肝癌細胞，而在正常的肝細胞則低表達。因此，制備IGF1R特異性瘤苗，可作為肝癌

2、治療的一種新思路。 樹突狀細胞（DC）是體內功能強大的專職性抗原提呈細胞，它能夠高效地攝取、處理抗原，并將處理后的多肽呈遞給靜息型T細胞，引起針對該抗原的特異性免疫反應。DC應用于腫瘤免疫洽療是目前的研究熱點，許多研究證實，腫瘤患者樹突狀細胞的質量及功能均減弱，MHC分子和共刺激分子CD80、CD86的表達量下降。因此，體外誘導功能正常的樹突狀細胞，經(jīng)修飾的腫瘤相關性抗原或特異性抗原，作為疫苗免疫腫瘤患者，是腫瘤治療的一個發(fā)展方

3、向。制備DC瘤苗的方法有腫瘤特異性或相關性抗原、腫瘤細胞裂解物與DC共培養(yǎng)，腫瘤細胞與DC融合、腫瘤細胞總mRNA轉染DC等。相關性抗原與DC共孵是常用的方法。 本研究擬構建IGF1RαcDNA真核表達載體，體外表達IGF1Rα蛋白片段，與DC細胞共孵，誘導針對表達IGF1R的HepG2特異性免疫反應，尋找新的治療肝癌的途徑，并初步探討肝癌相關性抗原IGF1R作為肝癌靶向治療的可行性。 方法：1．提取HepG2的RNA，

4、RT-PCR擴增IGFIRα蛋白片段序列，PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體的連接，經(jīng)過擴增測序確證后，利用pcDNA3/HA載體構建了IGFIRα段編碼區(qū)與載體HA的融合真核表達重組子，并在HEK293細胞中進行瞬時表達，轉染72小時通過Western印跡檢測2．取健康供者外周血單個核細胞，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個核細胞，貼壁法進一步純化細胞，收集非貼壁細胞（淋巴細胞）。貼壁細胞在細胞因子rhGM-CSF（1000 u/m

5、l），rhIL-4（100 ng/ml）作用下，體外誘導DC。收集培養(yǎng)4d的DC，將IGF1Rα蛋白加入DC中，另設不加抗原對照組和無關抗原對照組，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測表型，收集各組DC，與淋巴細胞按5：1比例混合接種于6孔板，培養(yǎng)7d，收集的細胞作為效應細胞。選擇表達IGF1R肝癌細胞株HepG2細胞作為靶細胞，按效靶比20：1、10：1混合接種培養(yǎng)48h，同時設單一靶細胞組、單一效應細胞組。以MTT法檢測效應細胞對

6、靶細胞的殺傷率。 結果：1．成功構建了IGF1α-pGEMT重組載體，測序后經(jīng)NCBI同源性比較，結果與IGF1R mRNA（NM000875）一致。進一步構建IGFlRα-pcDNA3/HA融合真核表達載體，用EcoRI/XhoI雙酶切確定。轉染HEK293蛋白表達，經(jīng)Western檢測，可檢測到分子量約為34KD的蛋白條帶，與預期的蛋白分子量一致。2．誘導的DC光鏡下，細胞周圍可見毛刺狀突起和樹枝狀突起，IGF1Rα蛋白刺激

7、的DC比未經(jīng)抗原刺激的DC的CD86、CD83、CD80、CD40都有所升高，表達量分別為87．9％，69．7％，88．69％，90．1％；而CD14水平下降，表達量僅為11．8％。說明IGFlRα蛋白刺激的DC比未經(jīng)抗原刺激的DC進一步成熟。MTT檢測對照組為未經(jīng)致敏的DC細胞激活的T細胞，空質粒轉染得到的蛋白致敏的DC細胞激活的T細胞，試驗組為目的基因真核轉染得到的目的蛋白致敏的DC細胞激活的T細胞，試驗組與對照組比有明顯的殺傷He

8、pG2細胞的作用（P<0．05），其活化的CTL對表達IGF1R的肝癌細胞株HepG2在效靶比為20．1時殺傷率為30．1％。對照組之間沒有明顯差異。在20：1和10：1情況下，目的蛋白致敏的DC細胞激活的T淋巴細胞對HepG2細胞與NIH3T3細胞的殺傷作用有明顯的差異（P<0．05）。 結論：我們的實驗證實構建表達的IGF1Rα蛋白片段具有良好的免疫原性，可以刺激DC細胞進一步成熟，致敏的DC可有效誘導CTL克隆的生成。提示