豬源優(yōu)良乳酸桿菌選育及其thyA基因缺陷型菌株的篩選.pdf

1、乳酸桿菌作為人及動物腸道正常菌群的優(yōu)勢菌，有諸多的益生功能，選擇它作為表達載體系統(tǒng)研制乳酸桿菌口服疫苗，可以實現(xiàn)乳酸菌的益生功能與外源基因特異性免疫的有效結(jié)合。已報道的乳酸桿菌的疫苗表達載體系統(tǒng)，大多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達的壓力，存在耐藥性基因擴散的問題。因此，以非抗生素抗性為標記和選擇壓力的系統(tǒng)的構(gòu)建，已成為新的研究熱點。 以非抗生素抗性為選擇壓力的染色體一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)，是以細菌的管家基因缺陷菌株為受體菌，在質(zhì)

2、粒上插入同源或異源完整受體菌缺陷的基因，作為外源基因表達載體穩(wěn)定的選擇性壓力。ThyA基因是細菌的一種管家基因，以其作為選擇壓力構(gòu)建的非抗生素抗性表達載體在國內(nèi)外的研究已較為成熟。 本實驗從健康仔豬腸道黏膜上分離到3株乳酸桿菌，種屬鑒定后初步認為其分別為嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)(命名為L1)、德氏乳桿菌德氏亞種(L.delbrueckii subsp.delbruecki)(命名為L5)和唾液乳桿菌(L.sali

3、varius)(命名為L13)。生長曲線測定結(jié)果表明，L1、L13的生長速度明顯高于L5。耐酸、耐膽鹽試驗結(jié)果表明，酸對L1生長的影響并不大，pH值超過2.5，菌株的存活基本不受影響；pH值為1.5處理30min仍有一定的存活率。L13耐酸能力相對較差，只能耐受pH3.5和4.5。L1比L13更能耐受高濃度膽鹽，在0.1％膽鹽條件下，兩株菌4h后布的存活率分別為70.00％和46.67％：但當膽鹽濃度為0.2％時，4h后L1菌株的存活率

4、為1.67％，而L13菌株的存活率極低，僅為0.0167％；膽鹽濃度升至0.3％，4h后兩株菌的存活率不超過0.01％。抑菌試驗結(jié)果表明，兩株乳酸菌對豬源大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。上述結(jié)果表明L1的性狀優(yōu)于L13，作為下一步試驗的侯選菌株。 對L1菌株進一步試驗，在添加一定濃度的胸腺嘧啶核苷和三甲氧芐二氨嘧啶的MRS選擇培養(yǎng)基上篩選得到TMP抗性、thyA基因突變型乳酸桿菌單菌落45個。將這45株

5、TMP抗性，thyA基因缺陷的嗜酸乳桿菌在豐富培養(yǎng)基中反復傳代，最終獲得一株生長良好、生物學性狀穩(wěn)定的thyA基因突變型嗜酸乳桿菌，命名為L1-30。將其在MRS培養(yǎng)基和MRS選擇培養(yǎng)基肉湯中傳代，每5代取200μL培養(yǎng)物涂MRS選擇培養(yǎng)基平板，計算每100個thyA基因突變菌落中，發(fā)生回復突變的比例。結(jié)果傳100代，先后207欠涂平板，在兩種培養(yǎng)基上均未發(fā)現(xiàn)有L1-30的回復突變株。認為該菌在胸腺嘧啶或胸苷酸豐富和貧乏的環(huán)境下均能保持