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文檔簡介
1、現代醫(yī)療技術的發(fā)展使許多以前難以開展的臨床高難診治技術得以實施,許多嚴重疾患病人因此得以存活,但危重病例比如膿毒癥(sepsis)的發(fā)病率也因此日漸增加。由于目前膿毒癥的治療措施尚無顯著進展,只有早期診斷、早期治療才有助于降低其死亡率。內皮細胞既是膿毒癥中的效應細胞和靶細胞,又在機體正常生理的維持中扮演著重要角色。因此,我們推測反映內皮細胞損傷的指標能間接反映膿毒癥中組織的損傷和炎癥輕重程度。在檢測臨床常規(guī)臟器功能指標的基礎上,監(jiān)測內皮
2、細胞狀態(tài)可望能更早、更敏感地判斷機體臟器綜合狀況。而目前已有的評價內皮細胞損傷程度的指標都存在不同程度的不足之處。 目的: 本實驗擬通過在膿毒癥動物模型中檢測血液中循環(huán)內皮細胞(circulatingendothelial cells,CECs)數量、內皮細胞特異性基因mRNA含量和臟器血管通透性、組織含水量來綜合反映內皮細胞損傷程度。同時觀察主要臟器組織學和功能的變化。分析內皮細胞損傷與重要臟器功能間的關系。并在動物實
3、驗的基礎上,初步研究臨床膿毒癥患者內皮細胞損傷與全身病情變化的關聯。 方法: 1、大鼠膿毒癥模型的制作及一般評價:90只大鼠分為6組,正常對照組,假手術(sham)組,盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)3h組,CLP6h組,CLP12h組和CLP24h組,每組15只。CLP大鼠結扎盲腸全長,16號針頭穿孔3個;sham組僅做剖腹術。36只大鼠(每組6只)鼠尾采血計數術前、術后全
4、血白細胞數量;術后相應時間點采集血清ELISA法檢測IL-6含量。 2、大鼠CLP后內皮細胞損傷的檢測:36只大鼠(每組6只)CLP術后相應時間點采血應用密度梯度分離法分離、計數CECs。36只大鼠(每組6只)術后相應時間點采血提取全血RNA,熒光實時定量PCR(real-time PCR)檢測內皮細胞特異性基因tie2、vegfr2的mRNA含量。應用伊文思蘭法和干濕比重法檢測18只(每組3只)大鼠心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟
5、組織的血管通透性和組織含水量變化。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評價及其與內皮細胞損傷的關聯分析:應用全自動生化分析儀檢測36只大鼠(每組6只)K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、AST、ALT、BUN和Cr的水平。同時HE染色觀察心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟的病理組織學變化。比較血循環(huán)中tie2、vegfr2的mRNA含量與上述生化分析指標的相關性。 4、膿毒癥患者內皮細胞損傷與病情變化的關聯分析:選擇重癥監(jiān)
6、護病房(intensivecare unit,ICU)的創(chuàng)傷患者,分為膿毒癥組和非膿毒癥組,在收入ICU的第1、3、7、14、21、28天采血提取全血RNA,real-time PCR檢測血循環(huán)中tie2的mRNA含量。同時應用ELISA法檢測血漿vwF的含量。分別分析tie2 mRNA含量與APACHEⅡ評分、vwF含量的關系。同時檢測血白細胞總數、AST、ALT、BUN和Cr的水平,并將之與tie2 mRNA含量比較。 結果
7、: 1、大鼠膿毒癥模型的一般評價:大鼠CLP后24小時死亡率為31.82%(7/22)。正常對照和sham組的白細胞數量無顯著差異。CLP3h組白細胞數量顯著升高(P<0.05),之后逐漸下降。與正常對照組比較,CLP組IL-6水平隨時間持續(xù)增長,但直到CLP后6h時IL一6增高幅度才具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),12h組、24h組IL-6水平進一步增加(P<0.01)。 2、CLP后內皮細胞傷情的評價:與正常對照比較
8、,CEC數量在CLP后3h達到峰值(P<0.05),隨后逐漸下降,CLP24h組CEC數量明顯低于3h、6h組(P<0.05)。CLP3h組循環(huán)血內皮細胞特異性基因tie2 mRNA含量顯著高于正常對照和CLP其余時間點(P<0.05),但vegfr2 mRNA水平在正常對照和CLP組間無顯著差異(P>0.05)。CLP后3h,大鼠心,肺的血管通透性明顯增加(P<0.05),CLP后6h觀察到肝臟血管通透性的增加(P<0.05)。直到傷
9、后12h腎臟的血管通透性才發(fā)生顯著變化(P<0.05)。在傷后12到24h各臟器的血管通透性一直維持在較高水平(P<0.05)。CLP后3h,大鼠心、腎組織含水量增高(P<0.05),12h時肝臟組織含水量上升(P<0.05)。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評價:CLP后肝細胞充血、變性。CLP后3h出現局灶性肺不張,肺泡內紅細胞滲出,并且不斷加重?;啬c黏膜充血、壞死、脫落。腎小球充血,小管內可見脫落的上皮細胞。心肌可見局
10、灶性出血。與正常對照比較,AST、ALT和BUN分別在CLP6h和CLP12h出現顯著增加(P<0.05)。血清K<'+>、Na<'+>、Cl<'->在CLP后有不同程度的升高(P<0.05)。 4、膿毒癥患者內皮細胞損傷程度與全身病情變化的關聯分析:膿毒癥組tie2mRNA含量顯著高于非膿毒癥組(p<0.01)?;颊叩腁PACHE Ⅱ評分與相應時間點血循環(huán)中tie2 mRNA含量呈高度正相關(p<0.01),Peason's相
11、關系數r=0.532(P<0.01)。其線形擬合方程為Y=12.66+4.922X(R<'2>=0.283)。血漿vwF含量在兩組患者間無顯著差異(P>0.05),但與循環(huán)tie2 mRNA水平顯著正相關(P<0.05),Peason's相關系數r=0.334.(p<0.05)。其線形擬合方程為Y=180.932+57.93X(R<'2>=0.112)。膿毒癥組全血白細胞總數顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。膿毒癥組的BuN和cr值也
12、顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。AsT和ALT在兩組間均無顯著差異(P>0.05)。 結論:1、本試驗制作的CLP膿毒癥模型為后續(xù)的實驗提供了可靠的模型基礎。 2、CLP后內皮細胞進行性損傷,表現為CECs數量和血液中tie2 mRNA含量增高,各主要臟器血管通透性增高,組織含水量增加。Real-time PCR檢測tie2 mRNA能靈敏反映內皮細胞的損傷程度。 3、CLP后大鼠主要臟器組織學水平進行性損傷
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