TGF-β-Smad4信號通路在BMSCs治療創(chuàng)傷弧菌膿毒癥肺組織損傷和血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建TGF-β基因沉默和Smad4基因沉默的慢病毒，轉(zhuǎn)染BMSCs細胞進行構(gòu)建TGF-β基因沉默細胞模型，轉(zhuǎn)染ICR小鼠進行構(gòu)建Smad4基因沉默的動物模型，觀察調(diào)控TGF-β和Smad4基因?qū)V感染后小鼠及BMSCs治療后的TGF-β、Smad4的蛋白及mRNA的影響，內(nèi)皮損傷因子sICAM-1、sVCAM-1、sP-selection、sE-selection、炎癥因子TNF-α、IL-6蛋白的影響，闡述TGF-

2、β/Smad4信號通路在BMSCs對肺組織損傷和血管內(nèi)皮細胞損傷保護中的作用和機制。
　　方法：
　　1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，并通過特異性抗體CD29抗體、CD90抗體、CD34抗體免疫熒光染色對其進行鑒定。
　　2.構(gòu)建TGF-β基因沉默和Smad4基因沉默的慢病毒，將TGF-β基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細胞進行構(gòu)建TGF-β基因沉默細胞模型，通過綠色熒光蛋白驗證慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，用S

3、mad4基因沉默的慢病毒轉(zhuǎn)染ICR小鼠，分別以Westernb lot、ELISA和Real-time PCR技術(shù)檢測 TGF-β和Smad4蛋白和mRNA的表達情況。
　　3.構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型，應用BMSCs和攜帶TGF-β siRNA的BMSCs進行干預，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、生理鹽水+BMSCs對照組(NSB組)、VV膿毒癥組(VV組)、VV膿毒癥+BMSCs治療組（VVB組）、VV膿毒癥+BMS

4、Cs-GFP治療組（VVG組）、VV膿毒癥+BMSCs-TGF-β siRNA治療組（VVT組）;構(gòu)建Smad4基因沉默的創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型，應用BMSCs進行干預，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、VV膿毒癥組（VV組）、VV+Smad4siRNA組(SRV組)、VV膿毒癥+BMSCs治療組(VVB組)、VV+Smad4siRNA+BMSCs治療組（SRVB組），用Western blot、ELISA和Real-time P

5、CR技術(shù)觀察TGF-β、Smad4蛋白和mRNA的變化，用ELISA法觀察炎癥因子TNF-α、IL-6蛋白的變化，用HE及透射電鏡觀察肺組織病理變化特點。
　　4.構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型，應用BMSCs和攜帶TGF-β沉默的BMSCs進行干預;將小鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、生理鹽水+BMSCs對照組(NSB組)、VV膿毒癥組（VV組）、VV膿毒癥+BMSCs治療組（VVB組）、VV膿毒癥+BMSCs-GFP治療組（V

6、VG組）、VV膿毒癥+BMSCs-TGF-β siRNA治療組（VVT組）;構(gòu)建Smad4基因沉默的創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型，應用BMSCs進行干預，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組）、VV膿毒癥組（VV組）、VV+Smad4siRNA組（SRV組）、VV膿毒癥+BMSCs治療組(VVB組)、VV+Smad4siRNA+BMSCs治療組（SRVB組），用ELISA法觀察內(nèi)皮損傷因子sICAM-1、sVCAM-1、sP-selectio

7、n、sE-selection蛋白的變化，用透射電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細胞的變化特點，用Tunel法觀察細胞凋亡情況，用免疫熒光雙染觀察Smad4在血管內(nèi)皮內(nèi)皮細胞上的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.細胞進行特異性抗體CD29抗體、CD90抗體、CD34抗體免疫熒光染色后顯微鏡觀察，可見鏡下細胞顯示CD29抗體（綠色熒光）陽性，CD90抗體（紅色熒光）陽性，CD34抗體陰性。提示提取培養(yǎng)細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2.通過

8、熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白，各轉(zhuǎn)染慢病毒載體組轉(zhuǎn)染效率均在90％以上;通過ELISA和Real-time PCR結(jié)果顯示TGF-β在TGF-β基因沉默慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs細胞組中表達量明顯降低，與其它組有顯著性差異(p＜0.05);通過Western-blot和Real-time PCR結(jié)果顯示Smad4在Smad4基因沉默的ICR小鼠動物模型中表達量明顯降低，與其他組有顯著差異(p＜0.05)。
　　3.應用攜帶TGF-β沉

9、默的BMSCs對創(chuàng)傷弧菌小鼠進行干預后和應用BMSCs干預Smad4基因沉默的創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型后，與NS組相比，SRV組和VV組小鼠肺組織TGF-β表達升高(p＜0.05)，Smad4表達明顯降低(p＜0.05)，12h達峰值，小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6蛋白水平均升高(p＜0.05);與VV組相比，VVB和VVG組小鼠12h、24h、48h肺組織TGF-β和Smad4表達明顯升高(p＜0.05)，小鼠血清中炎癥因子TN

10、F-α、IL-6蛋白水平明顯降低(p＜0.05)，VVT組未見明顯變化(p＞0.05)。光鏡下和透射電鏡下觀察NS組和NSB組病理學變化并不明顯，VV組肺組織損害明顯，12h達高峰，VVB和VVG組肺組織損害減輕， SRVB組和VVT組肺組織損害未見明顯改善。
　　4.應用攜帶TGF-β沉默的BMSCs對創(chuàng)傷弧菌小鼠進行干預后和應用BMSCs干預Smad4基因沉默的創(chuàng)傷弧菌膿毒癥小鼠模型后，，與NS組相比，SRV組和VV組小鼠透射

11、電鏡結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細胞腫脹、空泡變、破裂，內(nèi)皮細胞之間的緊密連接裂開，Tunel結(jié)果顯示細胞凋亡增加，小鼠血清中內(nèi)皮損傷因子sICAM-1、sVCAM-1、sP-selection、sE-selection蛋白明顯升高(p＜0.05)，免疫熒光結(jié)果顯示Smad4在血管內(nèi)皮細胞的表達減少。與VV組相比，VVB和VVG組小鼠透射電鏡結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細胞損傷減輕，Tunel結(jié)果顯示細胞凋亡減少，小鼠血清中內(nèi)皮損傷因子sICAM-1、sVCA

12、M-1、sP-selection、sE-selection蛋白明顯降低(p＜0.05)，免疫熒光結(jié)果顯示Smad4在血管內(nèi)皮細胞的表達增加，SRVB組和VVT組上述損傷改變并不明顯。
　　結(jié)論：
　　BMSCs細胞分離培養(yǎng)成功，TGF-β基因沉默細胞模型和Smad4基因沉默的動物模型構(gòu)建成功，BMSCs對創(chuàng)傷弧菌膿毒癥導致的肺組織損傷和血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，而攜帶TGF-β沉默的BMSCs則不能有效發(fā)揮作用，在Sma