同型半胱氨酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)體外培養(yǎng)胚胎期SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，添加同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)進(jìn)行干預(yù)，觀察Hcy對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響，并進(jìn)一步觀察其增殖期蛋白表達(dá)譜的變化，探討Hcy對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的機(jī)制;建立HuSH shRNA Plasmid介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)體系。
　　 方法：
　　 采用無(wú)血清體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)胚胎期大鼠NSCs，

2、將NSCs分為四組:①正常對(duì)照組(normal control group)培養(yǎng)基中葉酸含量為4μg/mL，同型半胱氨酸含量為0μg/mL;②葉酸缺乏組(Folic acid-D group)培養(yǎng)基中葉酸含量為0.65μg/mL，同型半胱氨酸含量為0μg/mL;③同型半胱氨酸中度增高組(Hcy-medium group)培養(yǎng)基中葉酸含量為4μg/mL，同型半胱氨酸含量為100μg/mL;④同型半胱氨酸高度增高組(Hcy-high gro

3、up)培養(yǎng)基中葉酸含量為4μg/mL，同型半胱氨酸含量為300μg/mL。采用MTT法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力，繪制生長(zhǎng)曲線;計(jì)數(shù)神經(jīng)球的數(shù)量及直徑以檢測(cè)神經(jīng)球的結(jié)球能力;采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞活力;培養(yǎng)6天后收集增殖期細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行雙向電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后使用PD-Quest軟件比對(duì)蛋白差異點(diǎn)，將篩選出的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。采用Real-time PCR法檢測(cè)經(jīng)質(zhì)譜鑒定蛋白mRNA表達(dá)水平。采用試劑盒檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞

4、內(nèi)ATP含量、SOD活力、MDA水平、ROS含量;測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物NADH-Q還原酶(CⅠ)、琥珀酸-Q還原酶(CⅡ)、細(xì)胞色素還原酶(CⅢ)及細(xì)胞色素氧化酶(CⅣ)的活性。采用HuSH shRNA Plasmid為載體建立RNA干擾技術(shù)體系。
　　 結(jié)果：
　　 添加Hcy后，NSCs增殖水平受到抑制。MTT結(jié)果顯示，添加Hcy后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力較正常對(duì)照組有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

5、。在Hcy添加組，神經(jīng)球直徑明顯減少，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;但神經(jīng)球數(shù)目各組間差異不明顯（P＞0.05）。將神經(jīng)球裂解后，計(jì)數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)，在兩組Hcy添加組，細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組有所減少，且呈濃度依賴性趨勢(shì)(P＜0.05）。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)各組間神經(jīng)干細(xì)胞活力差異不明顯(P＞0.05)。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，添加Hcy后神經(jīng)干細(xì)胞增殖期蛋白表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化;我們從差異蛋白中挑選出7種蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成

6、功鑒定6種蛋白;其中細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體-亞基2和烏頭酸水合酶為線粒體呼吸鏈和三羧酸循環(huán)涉及蛋白，提示Hcy可能是通過(guò)影響線粒體的功能而降低神經(jīng)干細(xì)胞增殖的。Real-time PCR結(jié)果顯示，細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體-亞基2和烏頭酸水合酶mRNA水平同樣被Hcy抑制。采用試劑盒檢測(cè)ATP含量發(fā)現(xiàn)Hcy降低了神經(jīng)干細(xì)胞的能量合成（P＜0.05）;降低了SOD活性(P＜0.05)，升高了MDA和ROS水平（P＜0.05）;且線粒體呼吸鏈復(fù)

7、合酶Ⅰ～Ⅳ的活性均受到不同程度的抑制（P＜0.05）。成功建立經(jīng)HuSH shRNA Plasmid介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)體系。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)成功分離、培養(yǎng)了體外胚胎期SD大鼠NSCs，研究結(jié)果顯示同型半胱氨酸可以抑制NSCs的增殖，降低神經(jīng)球的結(jié)球能力，影響NSCs增殖期蛋白表達(dá)譜的水平;在mRNA和蛋白水平均降低細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體-亞基2和烏頭酸水合酶的表達(dá);減少細(xì)胞內(nèi)ATP的含量，增加活性氧自由基生