急性CO中毒遲發(fā)性腦病大鼠模型腦內(nèi)免疫因子表達及膠質(zhì)細胞變化的研究.pdf

1、一氧化碳（carbon monoxide，CO）是由碳原子不完全燃燒產(chǎn)生的無色、無味、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的毒性氣體。CO中毒是當(dāng)今發(fā)生率和死亡率最高的中毒。 多見于火災(zāi)，機動車尾氣異常泄漏和工業(yè)或家庭燃氣爐取暖、做飯及沐浴等發(fā)生的事故中，也可見于CO自殺。CO中毒經(jīng)過治療，多數(shù)可以康復(fù)，但仍有3％~30％的患者經(jīng)過一段時間的“假愈期”（數(shù)日或數(shù)周），再次出現(xiàn)以癡呆、精神癥狀和錐體外系癥狀為主的神經(jīng)精神異常，稱為CO中毒遲發(fā)性腦病，簡稱遲發(fā)

2、性腦?。╠elayed neuropsychologic sequelae，DNS ），目前其發(fā)病機制仍未闡明。 近年，DNS的免疫機制越來越受到人們的重視。傳統(tǒng)觀點認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）是“免疫特免區(qū)”。但近年的研究表明，CNS并非絕對的免疫特免區(qū)，在特定條件下，CNS血腦屏障通透性會發(fā)生改變，允許血液中的免疫成分進入腦內(nèi)，同時CNS內(nèi)出現(xiàn)抗原提呈細胞（antigen pre

3、senting cells，APC）和免疫效應(yīng)細胞，釋放各種免疫因子、激活A(yù)PC提呈抗原，發(fā)揮抗原清除作用。CO中毒患者大腦缺血再灌注過程中會生成大量的自由基，這些自由基易使細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，腦組織在某些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的作用下，極有可能發(fā)生蛋白變性等病理改變，產(chǎn)生抗原性物質(zhì)，而且腦內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物本身也可作為抗原，激發(fā)CNS的免疫反應(yīng)。DNS的發(fā)病過程有一個明顯的“假愈期”，很有可能是腦損傷后CNS免疫反應(yīng)中免疫細胞的激活過程

4、所致。 膠質(zhì)細胞（neuroglia cells）在神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動中，起支持、營養(yǎng)、保護和修復(fù)神經(jīng)元的作用，是神經(jīng)系統(tǒng)不可缺少的部分。腦損傷時，不僅神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，膠質(zhì)細胞也通過增生、變形或分泌某些細胞因子對損傷產(chǎn)生反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元具有損害和保護雙重作用。哺乳動物胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟過程中，神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。而正

5、常成年哺乳動物CNS中僅存在少量神經(jīng)干細胞，主要聚集在側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone，SGZ)。 腦損傷后神經(jīng)干細胞可通過增殖、遷移和分化，修復(fù)腦組織損傷。CO中毒DNS患者發(fā)生腦損傷后，腦內(nèi)膠質(zhì)細胞及可分化為膠質(zhì)細胞的NSCs的變化應(yīng)該也有一定的規(guī)律。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)治療DNS效果顯著,提示HBO可

6、能通過影響DNS后膠質(zhì)細胞的變化而改善患者的臨床癥狀。 基于以上假設(shè)，本研究旨在通過建立DNS 大鼠模型，觀察與免疫反應(yīng)有關(guān)的因子，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）和γ-干擾素（interferon γ， IFN-γ）在DNS 大鼠腦中的表達情況，分析是否有免疫因素參與急性CO 中毒DNS 的發(fā)病過程，探討該病的發(fā)病機制；在此模型上進一步觀察腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞、

7、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)干細胞和神經(jīng)元的變化，同時給予HBO 治療后，觀察HBO 對上述細胞變化的影響，進一步探討急性CO 中毒DNS 的發(fā)病機制及HBO 治療DNS 的作用機制。我們采用急性靜態(tài)CO 吸入法建立急性CO 中毒遲發(fā)性腦病大鼠模型，通過組織病理學(xué)技術(shù)觀察模型大鼠腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)改變的特點；并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察細胞因子MHCⅡ和IFN-γ的表達、膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞的變化及HBO 治療對上述細胞變化的

8、影響。 其主要結(jié)果如下： （一）腦組織病理形態(tài)學(xué)改變H-E染色標(biāo)本上，DNS組大鼠腦內(nèi)發(fā)生廣泛的病理改變，皮質(zhì)、海馬及齒狀回出現(xiàn)大量的神經(jīng)元變性壞死。頂葉皮質(zhì)損傷最為嚴重，可見點片狀壞死，壞死神經(jīng)元呈三角形或多角形，細胞縮小，胞核固縮，核仁不清晰，周圍出現(xiàn)空暈，在變性壞死的神經(jīng)元周圍可見膠質(zhì)細胞增生；海馬錐體細胞層變薄，兩側(cè)細胞稀疏，CA1區(qū)壞死明顯。以上病理改變在染毒后各時間點均可觀察到，以染毒7d最為明顯。細胞超微結(jié)

9、構(gòu)觀察可見對照組海馬區(qū)神經(jīng)元大小正常，核膜完整，核仁清晰，細胞器完整，DNS組大鼠壞死神經(jīng)元體積增大，線粒體腫脹，細胞器崩解，染色質(zhì)密度增大，不均勻分布。 （二） MHCⅡ和IFN-γ的免疫組化染色對照組無或僅有少量MHCⅡ和IFN-γ表達，而DNS組在皮層和海馬區(qū)則有表達。MHCⅡ3d表達增強，7d數(shù)量較3d組多，表達達高峰（P<0.05），10d呈零星分布，20d幾乎無陽性細胞。IFN-γ 3d為表達高峰，7d有所下降，數(shù)量

10、較3d組少（P<0.05），10d、20d呈零星分布。 （三）腦內(nèi)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞的變化免疫組化結(jié)果顯示DNS組與對照組比較，少突膠質(zhì)細胞特征性標(biāo)志物（RIP）、巢蛋白（nestin）表達減少（P<0.05）；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、小膠質(zhì)細胞特征性標(biāo)志物（OX-42）的表達明顯增多（P<0.05），且陽性細胞形態(tài)發(fā)生改變，呈激活狀態(tài)。HBO治療組nestin、RIP較對照組表達減少（P<0.05），與DNS組相比數(shù)量

11、增多（P<0.05）；GFAP、OX-42較對照組表達增多（P<0.05），與DNS組相比數(shù)量減少（P<0.05）。 總之，通過本實驗的研究證明，急性CO中毒遲發(fā)性腦病大鼠模型腦中出現(xiàn)了免疫因子MHCⅡ和IFN-γ的表達。位置上，它們主要出現(xiàn)在神經(jīng)元變性壞死部位；時程上，它們的表達有一定的時間差。實驗還發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細胞形態(tài)、數(shù)量均發(fā)生變化，小膠質(zhì)細胞激活現(xiàn)象出現(xiàn)的位置和時程與MHCⅡ表達一致，且MHCⅡ形態(tài)上與小膠質(zhì)細

12、胞相似。因此，推測急性一氧化碳中毒后，腦組織在多種因素作用下，引起神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細胞形態(tài)數(shù)量變化，損傷的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞釋放細胞因子IFN-γ，使靜息的小膠質(zhì)細胞被激活成為抗原提呈細胞，同時表達MHCⅡ，APC將與MHCⅡ結(jié)合的抗原提呈給T淋巴細胞，造成腦組織免疫損傷，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害，最終引起該區(qū)域神經(jīng)元的遲發(fā)性壞死，同時由于神經(jīng)干細胞數(shù)量減少，腦組織修復(fù)能力降低，引起遲發(fā)性腦病的發(fā)生。在上述實驗的基礎(chǔ)上，進一步的研究重點應(yīng)是找到免