基于診斷治療學多功能納米系統(tǒng)用于肝細胞癌的分子診斷與治療.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，化學治療是臨床上主要的治療手段之一。目前，化療常常遇到以下兩個難題:
　?、僦委煼绞椒莻€體化，所有病人基于群體通用劑量給藥，會因病人個體差異等因素產(chǎn)生超敏或無效現(xiàn)象，導致用藥失敗;
　?、诏熜гu估往往在一個治療周期之后，具有時間滯后性，從而錯過了使治療最佳時機。
　　診斷治療學（Theranostics）是一種將分子診

2、斷與分子治療相結(jié)合的治療策略，近年來作為一種新型疾病治療策略，特別是在腫瘤治療方面受到了人們廣泛的關(guān)注?；谠\斷治療學的治療模式能夠?qū)崿F(xiàn)：
　　①可視化藥物體內(nèi)遞送過程;
　?、诳梢暬幬镌诮o藥靶部位的分布和釋放過程;
　　③在治療的同時進行診斷，實現(xiàn)腫瘤治療的實時監(jiān)控和個體化給藥等。
　　因此，診斷治療學對HCC治療過程中治療效果的實時監(jiān)控、及時調(diào)整給藥劑量或治療方案、實現(xiàn)病人個體化給藥并提高腫瘤治療效果具有重

3、要意義。
　　本課題基于Theranostics理論，設計和制備一種多功能納米載體用于HCC的個體化給藥，以提高治療效果，降低毒副作用。首先，選擇聚合物納米粒作為Theranostics載體，設計合成具有載藥、長循環(huán)和方便后期修飾的多功能材料聚乳酸-聚乙二醇-聚賴氨酸(poly(lactic acid)-Poly(ethylene glycol)-Polylysine，PLA-PEG-PLL)，具有pH敏感性和長循環(huán)性的多功能材料

4、聚組氨酸-聚乙二醇-生物素(Polyhistidine-Poly(ethylene glycol)-Biotin，PLH-PEG-Biotin）;然后，選取紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和索拉菲尼為治療HCC的模型藥物，基于釓(Gd)的磁共振顯影（Magnetic Resonance Imaging，MRI）模式為診斷手段，分別以腫瘤微環(huán)境高表達的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth fact

5、or,VEGF）、甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)和血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)為靶點，自組裝手段制備了三種多功能聚合物納米載體，分別為:
　?、侔邢蛑委煂W多功能納米粒（靶向VEGF載PTX聚合物納米粒，Target PTX-loaded nanoparticles，TPN）；
　?、谠\斷治療學多功能納米粒(靶

6、向AFP載Gd/PTX聚合物納米粒，Target Gd/PTX-loaded nanoparticles，TGPN)；
　　③pH敏感診斷治療學多功能納米粒(pH敏感靶向VEGFR載Gd/PTX聚合物納米粒，Target pH-sensitive theranostic nanoparticles，TPTN);
　　最后，分別對三種多功能納米載體的理化性質(zhì)、體外釋放行為、細胞毒性、細胞攝取、體外MRI性質(zhì)、體內(nèi)MRI性質(zhì)、體

7、內(nèi)抑瘤性質(zhì)和組織安全性等進行評價，以期提高HCC的分子靶向治療和治療監(jiān)控效果，實現(xiàn)HCC病人個體化治療。
　　課題主要研究方法與結(jié)果如下:
　　1.多功能材料的合成與表征
　　為構(gòu)建多功能診斷治療學聚合物納米載體，課題首創(chuàng)聚合物綴合技術(shù)，合成兩種新型多功能高分子材料PLA-PEG-PLL和PLH-PEG-Biotin。聚合物綴合技術(shù)是指利用化學反應，將具不同功能的單嵌段材料化學連接得到多嵌段多功能聚合物的技術(shù)。與傳統(tǒng)聚

8、合反應方法比較，該方法合成過程簡單，無需嚴苛的反應條件，產(chǎn)物純化簡單，并能夠相對準確地控制每一嵌段的分子量。此外，利用聚合物綴合技術(shù)可以將任意具有活性基團的嵌段相連接，具有多嵌段材料制備的可創(chuàng)造性。
　　1.1、PLA-PEG-PLL的合成與表征
　　利用酰胺反應，將PLA-COOH分別連接NH2-PEG-NH2得到PLA-PEG-NH2，然后連接PLL(Cbz)-COOH得到PLA-PEG-PLL(Cbz)，最后氨基脫保護

9、得到結(jié)合載藥、長循環(huán)和易于修飾多功能于一體的多功能材料PLA-PEG-PLL。通過核磁驗證了每一步合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過凝膠色譜得到PLA，PLA-PEG和PLA-PEG-PLL的數(shù)均分子量和多分散系數(shù)分別為13691(1.427)、16013(1.277)和20441(1.358)。利用芘熒光探針法測得PLA-PEG-PLL的臨界膠束濃度值為7.70×10-3mg/mL(3.76×10-7Mol/L)?；赑LA-PEG-PLL，利用酰

10、胺反應，合成了PLA-PEG-PLL-DTPA和PLA-PEG-PLL-Biotin，分別用于Gd裝載和靶向抗體修飾。
　　1.2、PLH-PEG-Biotin
　　利用酰胺反應，將Biotin-PEG-NH2與PLH-COOH反應得到PLH-PEG-Biotin，通過核磁驗證了合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過酸堿滴定實驗證明PLH-PEG-Biotin pKb值在pH5～7之間，處于血液pH與腫瘤微環(huán)境pH之間，具有在腫瘤組織實現(xiàn)納米

11、粒pH敏感性釋藥的能力。
　　2.靶向治療學多功能納米粒的制備與表征
　　靶向治療能夠提高HCC的治療效果，降低化療藥物對正常組織的毒性，是目前研究的熱點之一。因此，本文首先制備TPN用于HCC的靶向治療。首先建立PTX高效液相色譜檢測方法，PTX在選定液相條件下峰型良好，符合方法學考察要求。利用自組裝方法制得TPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為203.6±4.10nm，Zeta電位為20.76±0.34mv，包封率和載藥

12、量分別為86.23±1.79％和1.42±0.03％。在體外釋放實驗中，與Taxol(@)比較，TPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Higuchi方程Q=8.0449t1/2-0.5721，R=0.9678。細胞毒性實驗結(jié)果表明，TPN的細胞毒性（IC50=0.392±0.012μM）顯著高于Taxol(@)（IC50=3.554±0.233μM）和PN（IC50=1.510±0.099μM）(P＜0.01)，具有良好的體外抗腫瘤活性。在

13、細胞攝取實驗中，F(xiàn)ITC標記TPN的攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標記TPN的攝取率顯著高于FITC標記PN(P＜0.01)。在體內(nèi)腫瘤抑制實驗中，與NS、Taxol(@)、PN比較，TPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(P＜0.01)，TPN組生存時間（大于30d）長于Taxol(@)組(23d)和PN(27d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實驗結(jié)果表明TPN能夠?qū)崿F(xiàn)HCC的靶向治療，提高治療效果，具有重

14、要的應用前景。
　　3.診斷治療學多功能納米粒的制備與表征
　　為實現(xiàn)HCC的Theranostics，需要在腫瘤靶向治療的基礎上添加實時診斷模式。課題基于功能集成組裝的思路，將Gd的MRI顯影模式添加至TPN中，制備TGPN用于HCC的Theranostics研究。利用自組裝方法制得TGPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為147.50±4.71nm，Zeta電位為24.45±1.04mv，包封率和載藥量分別為88.76±1

15、.64％和1.59±0.06％。在體外釋放實驗中，與Taxol(@)比較，TGPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Weibull方程lnln[1/(1-Q/100)]=0.696lnt-6.5891(R=0.9533)。在細胞毒性實驗中，TGPN在24h的細胞毒性高于Taxol(@)和GPN(P＜0.05)，具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標記TGPN的細胞攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在AFP陽性HepG2細胞中，孵育0.5h后，F(xiàn)I

16、TC標記TGPN的攝取率顯著高于FITC標記GPN(P＜0.01)，在AFP陰性B16細胞中，F(xiàn)ITC標記TGPN與FITC標記GPN的攝取率之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，證明AFP抗體能夠促進TGPN在HepG2細胞中的攝取。體外MRI評價表明TGPN具有高弛豫率(25.388mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的5.18倍。在體內(nèi)MRI實驗中，給藥TGPN后，小鼠腫瘤區(qū)域的顯影信號增強AUC值為馬根維顯(

17、@)的87.6倍，信號峰值為馬根維顯(@)的2.94倍，并能顯著延長診斷時間，從馬根維顯(@)的小于1h延長至6h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。與NS、Taxol(@)、比較，TGPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(P＜0.01)，TPN組生存時間(20d)長于Taxol(@)組(11d)和PN(15d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實驗結(jié)果表明TGPN具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力，能夠?qū)崿F(xiàn)治療過程的實時檢測，從而利于實現(xiàn)

18、給藥個體化，具有重要的應用潛力。
　　4.pH敏感診斷治療學多功能納米粒的制備與表征
　　腫瘤組織的定位釋藥策略能夠提高診斷治療學納米載體治療效果和診斷靈敏度，更有利于發(fā)揮Theranostics策略優(yōu)勢。因此，本文設計具有pH響應性釋藥能力的Theranostics納米粒，制備TPTN用于HCC的診斷治療研究。首先建立索拉菲尼高效液相色譜檢測方法，索拉菲尼在選定的液相條件下峰型良好，符合方法學考察要求。利用自組裝方法制得T

19、PTN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為181.4±3.4nm，Zeta電位為14.95±0.60mv，包封率和載藥量分別為95.02±1.47％和2.38±0.04％。在含10％血清條件下，TPTN在2～4h內(nèi)粒徑保持穩(wěn)定，證明穩(wěn)定性良好。在體外釋放實驗中，TPTN的釋放具有pH依賴性，其在pH=5.0的釋放介質(zhì)中釋放速率顯著高于pH=7.4的釋放介質(zhì)(P＜0.01)。在細胞毒性實驗中，TPTN在pH=5.0環(huán)境中孵育1h后的細胞毒性與

20、索拉菲尼溶液相當，證明TPTN具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標記TPTN的細胞攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標記TPTN的攝取率顯著高于FITC標記PTN(P＜0.01)。體外MRI評價表明TPTN具有高弛豫率(17.300mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的3.53倍。腫瘤模型小鼠靜脈給藥TPTN后，小鼠腫瘤區(qū)域與周圍組織之間的信號對比明顯，肉眼可以觀察到明顯的腫瘤邊界，并能顯著延長

21、診斷時間，從馬根維顯(@)的小于1h延長至1.5h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。在體內(nèi)腫瘤抑制實驗中，與NS、索拉菲尼溶液（口服或靜注）、PTN比較，TPTN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(P＜0.01)，說明TPTN具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過組織免疫切片觀察，小鼠靜脈注射TBN后，各個臟器與注射生理鹽水組相應臟器比較沒有明顯的組織毒性，證明TBN是一個相對安全的載體。以上實驗結(jié)果表明TPTN在具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力的同