sBLyS表達(dá)條件的優(yōu)化及純化.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子（BLyS／TALL-1／zTNF4／BAFF／THANK）是1999年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族成員（TNFSF）之一。BLyS的主要作用是刺激B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體，其正常表達(dá)對(duì)維持依賴和不依賴T細(xì)胞抗原刺激的B細(xì)胞活化和增殖至關(guān)重要。因此，可作為體液免疫增強(qiáng)劑。從Blys發(fā)現(xiàn)至今，已有數(shù)家世界著名的生物技術(shù)公司著手對(duì)BIyS及其受體的研究開發(fā)。其中，HGSI公司的重組BLyS已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床期實(shí)

2、驗(yàn)。 然而蛋白質(zhì)多肽類藥物的作用位點(diǎn)專一、療效確切。但溶解度低、穩(wěn)定性差、半衰期短、存在免疫原性等缺陷，限制了其給藥途徑和藥效的發(fā)揮。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾可以很好地解決上述問題。本論文希望通過PEG修飾的方法，增加sBLyS的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的半衰期。 本文在對(duì)sBLyS純化和PEG修飾的研究主要分為三個(gè)部分： 首先，本論文考察了不同誘導(dǎo)時(shí)間目的蛋白的表達(dá)量，以及不

3、同溫度下目的蛋白的表達(dá)量。在確定了誘導(dǎo)時(shí)間和溫度后，超聲檢測(cè)不同條件下上清中目的蛋白的含量。然后考察IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。最終確定最佳誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間10小時(shí)，IPTG濃度3 mmol／L。 其次，根據(jù)最佳誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間10小時(shí)，IPTG濃度3mmol／L進(jìn)行大量誘導(dǎo)，使用使用Ni2+-NTA親和層析純化蛋白。洗脫時(shí)采取梯度洗脫的方法，Wash Buffer為咪唑濃度為20mmol／L的磷酸鹽緩沖液，

4、Elution Buffer定為咪唑濃度250mmol／L的磷酸鹽緩沖液，5mL注射器作為層析柱，柱料高度約為1cm，純化目的蛋白分子量約為20 kDa，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 最后，目的蛋白經(jīng)透析和冷凍干燥后用0.2M磷酸緩沖液（pH8.00）50μL溶解，配成濃度為12mg／mL sBLyS溶液，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白分子量約為20kDa，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，準(zhǔn)備進(jìn)行下一步PEG修飾。 本文主要工作是建立了sBLyS表達(dá)