p300及其結(jié)合功能在缺氧神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、缺氧是許多疾病所共有的一個(gè)基本病理過程。是臨床醫(yī)學(xué)、高原醫(yī)學(xué)、航空航天醫(yī)學(xué)等研究的核心問題。研究缺氧發(fā)生和發(fā)展的規(guī)律以及缺氧習(xí)服機(jī)制，對于保障高原建設(shè)者和世居高原人群的健康、邊疆地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展、鞏固國防以及拓寬人類生存空間具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。腦是機(jī)體內(nèi)各系統(tǒng)缺氧反應(yīng)的主宰者，只有在腦組織功能正常的情況下，才有可能通過呼吸、循環(huán)、血液等系統(tǒng)建立起一整套適應(yīng)缺氧環(huán)境的代償機(jī)制，因此，缺氧中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及習(xí)服的分子機(jī)制是高原醫(yī)學(xué)研究的首

2、要問題之一?；虿町惐磉_(dá)是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的核心機(jī)制，是生物體完成基本生命活動(dòng)以及對外界刺激作出應(yīng)答的分子基礎(chǔ)。闡明基因選擇性表達(dá)所依賴的調(diào)控信息及其相互作用的分子機(jī)制，已經(jīng)成為功能基因組學(xué)領(lǐng)域內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控研究國際競爭的焦點(diǎn)。對低氧應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及調(diào)控信息的認(rèn)識成為研究缺氧中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及習(xí)服的核心內(nèi)容之一。 人類基因組系統(tǒng)分析的結(jié)果告訴我們，在序列占有量還不到整個(gè)基因組2％的蛋白質(zhì)組中，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)

3、了相當(dāng)大的比例，約3000左右。這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控基因表達(dá)時(shí)相互作用，形成了極為復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從研究單一的調(diào)控環(huán)節(jié)拓展到深入探討它們之間的相互聯(lián)系及其控制過程，從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度探尋低氧適應(yīng)基因及其誘導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于更深入認(rèn)識低氧適應(yīng)的分子機(jī)制，而且可為有效預(yù)防高原低氧損傷醫(yī)學(xué)措施的制定提供更直接的科學(xué)依據(jù)。 近十年的研究證實(shí)，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，除了轉(zhuǎn)錄因子這一活躍的因素以外，轉(zhuǎn)錄輔激活子因其多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合功

4、能，而成為網(wǎng)絡(luò)中活躍的因素之一。轉(zhuǎn)錄輔激活子表達(dá)變化及其結(jié)合蛋白譜的改變成為聯(lián)系外界信號和基因表達(dá)的中心環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄輔激活子p300在缺氧基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，已發(fā)現(xiàn)多種缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的發(fā)揮依賴p300，p300的蛋白結(jié)合功能受外界環(huán)境、細(xì)胞環(huán)境的精密調(diào)控。我們推測p300蛋白表達(dá)量、蛋白結(jié)合功能是影響缺氧相關(guān)基因的選擇性表達(dá)的重要方面。而相關(guān)的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。 本研究以大鼠海馬組織及NPC12細(xì)胞為研究對象，探討p30

5、0表達(dá)及其結(jié)合功能在缺氧神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用。課題分為四個(gè)部分：一、比較大鼠p300蛋白表達(dá)的細(xì)胞、組織和性別差異性；二、利用低壓艙模擬高原5000m低氧環(huán)境，從整體動(dòng)物水平，闡明缺氧對p300基因表達(dá)及其結(jié)合功能的影響；三、以NPC12細(xì)胞為對象，利用CoCl2處理構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型，從細(xì)胞水平闡明p300表達(dá)變化及其結(jié)合功能改變對CoCl2處理細(xì)胞損傷的影響；四、利用RNAi技術(shù)抑制NPC12細(xì)胞中p300的表達(dá)，進(jìn)一步闡明p300表

6、達(dá)變化及其結(jié)合功能改變對CoCl2處理細(xì)胞損傷的影響，并比較了p300表達(dá)抑制后，NPC12細(xì)胞對CoCl2處理以及低氧培養(yǎng)耐受性變化的差異。 本課題的研究結(jié)果如下： 一、大鼠組織中p300蛋白表達(dá)及分布特點(diǎn)。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫印跡技術(shù)，對大鼠不同組織中p300蛋白的表達(dá)和分布進(jìn)行檢測，探討p300在組織蛋白差異表達(dá)中的作用。結(jié)果顯示，p300蛋白在心肌、肝臟、肺臟、腎臟、睪丸、小腦、海馬、大腦皮質(zhì)中均有分布，定

7、位于核內(nèi)。睪丸組織里p300主要分布在生精小管外層的精原細(xì)胞中，在成熟精子細(xì)胞未檢測到陽性表達(dá)；腎臟中p300主要分布在髓質(zhì)上皮細(xì)胞；海馬p300主要分布在錐形神經(jīng)元層；大腦皮質(zhì)中p300主要分布在皮質(zhì)神經(jīng)元，在分子層中表達(dá)弱陽性；小腦蒲肯野細(xì)胞中p300表達(dá)強(qiáng)陽性。肝臟的肝細(xì)胞中p300均勻分布，肺臟中p300表達(dá)較弱。雌性大鼠p300蛋白在心肌、比目魚肌表達(dá)水平高，其次是腎臟、肝臟，在下丘腦中未檢測到明顯的陽性表達(dá)；雄性大鼠p300

8、蛋白在心肌、比目魚肌表達(dá)水平高，其次是小腦、肝臟和睪丸，在下丘腦中未檢測到明顯的陽性表達(dá)；雌性大鼠心肌和腎臟組織中p300蛋白水平高于雄性大鼠。結(jié)論：p300是普遍表達(dá)的核蛋白，其分布和表達(dá)水平有細(xì)胞、組織和性別差異性，p300可能在細(xì)胞、組織對外界刺激的反應(yīng)性差異中起作用。 二、缺氧對p300蛋白表達(dá)、分布及其結(jié)合功能的影響。利用RT-PCR、Westernblot、免疫共沉淀、斑點(diǎn)雜交技術(shù)分析模擬海拔5000m連續(xù)缺氧過程中

9、大海馬組織p300表達(dá)和結(jié)合功能的改變，探討p300在缺氧神經(jīng)細(xì)胞損傷-習(xí)服機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示：①缺氧過程中大鼠海馬組織錐形神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：與平原對照組相比，缺氧1天組海馬組織中未見明顯改變，缺氧5天、15天和30天時(shí)，部分神經(jīng)元體積變小，染色質(zhì)聚集深染，部分神經(jīng)元核呈梭形或三角形，固縮深染。②缺氧對大鼠海馬組織中p300分布的影響：缺氧過程中，p300陽性細(xì)胞仍然集中在錐形神經(jīng)元層。③缺氧對大鼠海馬組織中p300mRNA表達(dá)

10、的影響：缺氧1天后，p300轉(zhuǎn)錄水平增加，在缺氧五天時(shí)達(dá)到高峰，缺氧15天時(shí)下降，缺氧30天時(shí)較缺氧15天略有上升，但沒有顯著差異。缺氧各組p300mRNA量與平原對照組相比，差異具有顯著意義。④缺氧對大鼠海馬組織中p300蛋白表達(dá)的影響：缺氧1天后，p300蛋白水平增加，缺氧各組間的p300蛋白量差異無顯著意義。缺氧各組與平原對照組的差異有顯著意義。⑤缺氧對大鼠海馬組織p300與HIF-1α、p65結(jié)合率的影響：p300與HIF-1α

11、結(jié)合在缺氧1天時(shí)最高，隨后下降；p300與p65結(jié)合在平原對照組中最高，在缺氧1天后下降，在缺氧15天時(shí)，略有回升，但仍低于平原對照組。⑥缺氧過程中大鼠海馬組織p300結(jié)合蛋白譜變化：通過一維電泳的分離結(jié)果顯示，各組間蛋白結(jié)合的種類有明顯差異。結(jié)論：模擬海拔5000m缺氧不僅上調(diào)大鼠海馬組織中p300的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，而且影響p300的蛋白結(jié)合功能，提示p300在缺氧海馬的病理生理活動(dòng)中起作用，蛋白表達(dá)增加以及結(jié)合蛋白功能的改變p300

12、發(fā)揮作用的兩種方式。 三、CoCl2處理對NPC12p300蛋白的表達(dá)和結(jié)合功能的影響。以NPC12細(xì)胞為細(xì)胞模型，利用Westernblot、免疫共沉淀、斑點(diǎn)雜交技術(shù)觀察CoCl2處理對p300表達(dá)和結(jié)合功能的影響及其與NPC12細(xì)胞損傷的關(guān)系。1、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：對同一視野下細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果顯示，處理后3h，細(xì)胞突起增多，胞體變小，隨著處理時(shí)間的延長，突起縮短，胞體皺縮，

13、光暈逐漸消失，到48h時(shí)大部分細(xì)胞裂解、死亡。2、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細(xì)胞活力的變化：①LDH釋放率的變化：未處理NPC12細(xì)胞，在培養(yǎng)6h時(shí)，LDH釋放率下降，與3h時(shí)相比差異具有顯著意義，在12h以后，LDH釋放率增加；處理NPC12細(xì)胞，LDH釋放率變化呈同樣的變化規(guī)律，但處理12h以后，處理組LDH釋放率顯著高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)未處理組。②細(xì)胞存活率的變化：200μmol/L處理細(xì)胞組存活率在24h時(shí)顯

14、著高于未處理組細(xì)胞，隨后下降。500μmol/L處理細(xì)胞組存活率顯著下降，低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)200μmol/L處理細(xì)胞組和未處理組細(xì)胞。③MTT法檢測NPC12細(xì)胞活力變化：200μmol/L處理細(xì)胞組活力在12h顯著低于非處理組細(xì)胞，500μmol/L處理細(xì)胞組活力顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)200μmol/L處理細(xì)胞組和未處理細(xì)胞。3、CoCl2處理對NPC12細(xì)胞p300表達(dá)和分布的影響：p300蛋白水平在CoCl2處理后6h明顯增加，并持續(xù)高

15、表達(dá)至24h，隨后下降，但仍高于處理前。p300表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)的非核仁區(qū)。4、CoCl2處理NPC12細(xì)胞p65的表達(dá)和分布的影響：p65蛋白水平在CoCl2處理后3h增加，在6h達(dá)到高峰，隨后下降。處理前p65蛋白主要分布在細(xì)胞胞漿，在處理后6h，p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，并在隨后處理至24h內(nèi)在核內(nèi)和胞漿中均有分布，在處理48h時(shí)，部分細(xì)胞中核內(nèi)p65的分布降低。5、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細(xì)胞p300與HI

16、F-1α、p65結(jié)合率的變化：CoCl2處理過程中，p300與HIF-1的結(jié)合在3h時(shí)最高，隨后下降，而p300與p65的結(jié)合在CoCl2處理過程中下降，在48h時(shí)增加。 結(jié)論：CoCl2處理上調(diào)NPC12p300蛋白表達(dá)，影響p300的蛋白結(jié)合功能，但p300-p65結(jié)合不受p300和p65蛋白水平變化的影響，可能與其它機(jī)制有關(guān)。p300表達(dá)和結(jié)合功能的時(shí)空變化趨勢與NPC12細(xì)胞活力的改變一致，提示p300可能是影響NPC1

17、2細(xì)胞CoCl2耐受性的重要因素。 四、干擾p300表達(dá)后NPC12細(xì)胞對CoC12、低氧培養(yǎng)耐受性的影響。通過RNA干擾抑制p300蛋白表達(dá)，觀察NPC12細(xì)胞對CoCl2、低氧培養(yǎng)的耐受性改變，探討p300在不同的缺氧模式中的作用差異。 綜上所述，缺氧能上調(diào)p300蛋白表達(dá)，影響其蛋白結(jié)合功能，但p300對CoCl2和低氧處理?xiàng)l件下神經(jīng)細(xì)胞耐受性的影響不同：抑制p300表達(dá)，NPC12對CoCl2處理的耐受性增加，但