三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細胞系A(chǔ)GS凋亡及對其STAT3、VEGF表達的影響.pdf

1、三氧化二砷(arserlic trioxide，As<,2>O<,3>)是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，幾世紀前人們就應(yīng)用砷劑治療多種疾病，目前已在臨床得到廣泛的應(yīng)用。20世紀90年代我國哈爾濱醫(yī)科大學(xué)首先用三氧化二砷治療急性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)取得顯著療效，對復(fù)發(fā)、難治病例亦有良好療效，且與維甲酸(retinoic acid，RA)無交叉耐藥，亦無骨髓抑制作用，其副作用不

2、明顯，經(jīng)對癥治療后可迅速消失。上海血液研究所發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可誘導(dǎo)APL細胞凋亡和部分分化。在過去的十多年里，三氧化二砷己被廣泛證明是一種治療急性早幼粒性白血病的有效制劑。最近幾年來，國內(nèi)外對二氧化二砷與腫瘤的研究發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷對惡性淋巴系統(tǒng)疾病、白血病甚至實體瘤都有令人振奮的治療效果。 雖然三氧化二砷應(yīng)用于臨床己取得了很好效果，關(guān)于其應(yīng)用也積累了很多經(jīng)驗，但是，人們對于三氧化二砷治病的分子機制還知之甚少。目前，這方面的

3、研究在國際上愈來愈成為一個熱點。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷不僅對急性早幼粒細胞性白血病有效果，而且對其他類型的白血病以及其他許多惡性腫瘤都有良好的治療效果。1996年《Scierice》著文稱“這是繼ATRA之后又一另人震驚的發(fā)現(xiàn)”。大量資料表明，三氧化二砷對多種實體瘤均具有良好的治療效果，其作用機制主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、抑制癌細胞增殖和血管生成等多種細胞調(diào)節(jié)機制治療癌癥。同時通過對相關(guān)凋亡基因的調(diào)控及對一些信號通路的影響，誘導(dǎo)

4、多種實體瘤細胞凋亡。 近年來腫瘤細胞凋亡的分子機制，特別是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究日益受到重視。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal trarIsdtmers and activators oftranscription，STAT)是細胞因子和生長因子受體信號的下游效應(yīng)物。目前在哺乳動物中已鑒定出STAT家族的7個成員，即Stat1，Stat2，Stat3，Stat4，Stat5a，Stat5b和Stat6。此信號通常產(chǎn)生于細胞膜表面

5、的受體，然后傳輸至細胞核內(nèi)，STAT在細胞核內(nèi)與特異性的DNA啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達<'[1-4]>。Stat3(signal transdtlcers and activators of transcription3，Stat3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白是近年來研究異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子，目前進行的一些有關(guān)細胞培養(yǎng)和動物模型實驗，已確認Stat3信號途徑是多種人類腫瘤干預(yù)治療有效的分子標靶<'[5-8]>。目前國外有關(guān)STAT

6、信號傳導(dǎo)途徑的研究正蓬勃發(fā)展，但大部分多集中在惡性血液系統(tǒng)疾病(白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨肉瘤)和頭頸部腫瘤、乳腺癌和前列腺癌等方面，國內(nèi)外關(guān)于Stat3在消化系統(tǒng)疾病中的研究才剛剛起步，而探討Stat3與胃癌細胞和組織關(guān)系的報道則更少見，因此，發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｑ軆?nèi)皮生長因子(vasctllar endothelial growth factor，VEGF)又稱血管通透因子(vascylar permeability factor，VPF

7、)是1989年由Connolly等發(fā)現(xiàn)并命名的一種糖蛋白，為血管生成的主要調(diào)控因子，是一種強烈的內(nèi)皮細胞有絲分裂原和促血管生長因子，在腫瘤患者體內(nèi)主要來源于腫瘤細胞，通過與內(nèi)皮細胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)活性。血管生成對促進實體瘤生長和血行播散的作用目前已較明確，腫瘤細胞誘導(dǎo)血管生成的能力已被視為其生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件，同時血管生成的發(fā)生還被認為是腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵事件?，F(xiàn)已經(jīng)證明三氧化二砷能夠抑制腫瘤細胞血管形成。在V

8、EGF作用于血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮促血管生成作用的過程中，濃度為10 ng/ml的VEGF即可效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞Stat3磷酸化<'[9]>。而VEGF在腫瘤細胞內(nèi)是否遵循血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，尤其是Stat3是否參與信號傳導(dǎo)，目前尚不明確。胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位，每年約有17萬人死于胃癌，幾乎接近全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4，且每年新增胃癌患者2萬人以上，是一種嚴重威脅人民身體健康的疾病。胃癌

9、對放、化療的敏感性均較低，行胃癌根治手術(shù)的病例有30﹪左右復(fù)發(fā)。因此尋找對胃癌行之有效的治療方法具有十分重大的意義。 目的：本實驗以胃癌細胞系A(chǔ)GS為研究對象，探討三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的相關(guān)分子機制。并探討凋亡過程中三氧化二砷對凋亡相關(guān)基因p53、bc1-2及細胞周期調(diào)控基因p21的影響。研究Stat3信號途徑對VEGF表達的影響以及與p53、bc1-2和p21的關(guān)系，及其在凋亡與胃癌血管形成調(diào)控中的作用。旨在探索三氧化二

10、砷誘導(dǎo)胃癌細胞系A(chǔ)GS凋亡可能的分子機制，為尋找新的有效治療胃癌的藥物提供理論依據(jù)。 方法：(1)分別用1、5、10 μmol/L三氧化二砷處理AGS細胞，在培養(yǎng)24、48、72 h后，采用MTT法檢測三氧化二砷對該細胞株生長增殖的影響，以不加藥組作為空白對照； (2)流式細胞術(shù)(FCM)、3’-OH末端標記法(TUNEL)和DNA ladder檢測細胞凋亡； (3)FCM和免疫組化法檢測Stat3和VEGF蛋白變化；(4)用E

11、LISA法檢測不同濃度和時間段細胞培養(yǎng)上清中VEGF表達變化；(5)用RT-PCR檢測凋亡過程中凋亡相關(guān)基因p-53和bcl-2及細胞周期調(diào)控基因p21 mRNA的變化。并檢測VEGF和細胞信號通路中Stat3 mRNA的表達變化；(6)Western Blot檢測AGS細胞中P-Stat3表達變化。 結(jié)果：(1)AGS細胞經(jīng)三氧化二砷作用后，細胞增殖受到明顯抑制，且呈劑量和作用時間依賴關(guān)系； (2)FCM檢測在細胞周期G<,1>

12、期前出現(xiàn)“亞二倍體”凋亡峰，并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系；細胞周期中G<,2>期細胞增多，G<,1>期細胞減少，S期細胞的比例未發(fā)生明顯的變化。提示細胞周期明顯阻滯于G<,2>/M期。 (3)TUNEL標記發(fā)現(xiàn)DNA鏈的斷裂，DNA ladder發(fā)現(xiàn)斷裂的DNA呈現(xiàn)‘梯形’條帶變化； (4)凋亡相關(guān)基因p53mRNA表達升高，bcl-2mRNA表達明顯降低；細胞周期相關(guān)基因p21mRNA表達增高；(5)AGS細胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)基因Stat3

13、表達下調(diào)，VEGF表達下調(diào)，其中以10μmol/L濃度的三氧化二砷作用更強。(6)AGS中存在Stat3的組成性激活，且p-Stat3的表達隨As<,2>O<,3>濃度增大表達下降。 結(jié)論： (1)不同濃度的三氧化二砷抑制胃癌細胞系A(chǔ)GS增殖并誘導(dǎo)凋亡，且與凋亡的程度呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。其凋亡發(fā)生機制可能與凋亡相關(guān)基因p53上調(diào)及抗凋亡bcl-2基因的下調(diào)密切相關(guān)。p21基因表達下調(diào)可能是誘導(dǎo)細胞周期阻滯的機制之一。(2)細胞

14、信號途徑中Stat3蛋白表達下降，可能作為胃癌細胞AGS凋亡相關(guān)基因和細胞周期調(diào)控基因的上游基因，抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期的停滯。Stat3還可能作為VEGF的上游基因下調(diào)VEGF基因表達，阻止胃癌血管的形成，進而對胃癌血管的形成起到調(diào)控作用。 (3)胃癌細胞系A(chǔ)GS中存在Stat3的磷酸化，三氧化二砷通過抑制P-Stat3的表達，誘導(dǎo)AGS細胞凋亡。JAK/STAT信號通路中Stat3的激活與三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細胞系A(chǔ)GS