產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵的代謝機(jī)理.pdf

1、甘油是一種重要的輕化工原料，已廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品和國(guó)防等十多個(gè)領(lǐng)域的1700多種產(chǎn)品。近些年來(lái)，利用耐高滲酵母生產(chǎn)甘油越來(lái)越引起人們的關(guān)注。耐高滲酵母——產(chǎn)甘油假絲酵母是本研究室擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的甘油生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵生產(chǎn)甘油具有高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高回收率等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)得到了較好的工業(yè)化應(yīng)用。但是，迄今為止，我們對(duì)其遺傳背景依然知之甚少，更沒有從細(xì)胞全局性水平的高度對(duì)其復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)中各代謝途徑之間的關(guān)系做深入透徹的研究，而這些方面

2、的知識(shí)只是更多地借鑒了釀酒酵母等其它酵母的有關(guān)研究成果。 本文根據(jù)微生物代謝及其調(diào)控理論研究產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵的代謝機(jī)理，探討其甘油合成途徑與EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以此闡明產(chǎn)甘油假絲酵母高產(chǎn)甘油的內(nèi)在本質(zhì)，并為將來(lái)對(duì)甘油合成及其下游產(chǎn)品(如1，3-丙二醇)的代謝工程研究打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)將取得的主要研究成果歸納如下： 1.以復(fù)合培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基進(jìn)行比較發(fā)酵，研究了玉米漿及其主要成分在產(chǎn)甘油假

3、絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵過(guò)程中的作用機(jī)理。結(jié)果表明：用復(fù)合培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘油時(shí)，玉米漿用量決定了發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、甘油合成和葡萄糖消耗的情況，其濃度的較小變化即可引起發(fā)酵過(guò)程和結(jié)果的顯著變化。玉米漿磷可以調(diào)節(jié)EMP途徑與HMP途徑之間葡萄糖代謝流的分布；隨著玉米漿磷濃度的增加，HMP途徑被抑制而EMP途徑被激活，結(jié)果細(xì)胞生物量增加。玉米漿氮也可作為氮源被利用，但它并不是產(chǎn)甘油假絲酵母的適宜氮源。玉米漿中的微量元素能夠顯著提高葡萄糖的消耗速率、

4、促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和提高甘油產(chǎn)量。 2.對(duì)不同發(fā)酵階段用于菌體生長(zhǎng)、代謝維持、甘油合成和副產(chǎn)物形成所消耗的葡萄糖進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。當(dāng)玉米漿作磷源時(shí)，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Xm隨玉米漿濃度增加而線性遞增，且發(fā)酵過(guò)程中甘油合成與菌體生長(zhǎng)耦聯(lián)緊密；當(dāng)KH2PO4濃度在0.49-0.73g/L范圍內(nèi)時(shí)，Xm、μm基本恒定，甘油合成與菌體生長(zhǎng)相關(guān)性較小。隨著培養(yǎng)基中磷濃度增高，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中用于菌體產(chǎn)生和維持代謝所消耗的葡萄糖基本保持穩(wěn)定，而在快速生長(zhǎng)

5、階段兩者之和呈遞增趨勢(shì)；但是無(wú)論在哪個(gè)階段，用于甘油合成所消耗的葡萄糖先隨磷濃度升高而增加然后逐漸減少。副產(chǎn)物的形成主要發(fā)生在快速生長(zhǎng)階段，而穩(wěn)定期生成的副產(chǎn)物很少。當(dāng)玉米漿濃度為14g/L、KH2PO4濃度為0.57g/L時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物最少，分別為5.8％和4.3％；甘油對(duì)葡萄糖得率最高，分別達(dá)到0.534g/g和0.528g/g。 3.在28-36℃范圍內(nèi)，由于發(fā)酵周期隨溫度升高而顯著縮短，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、甘油

6、合成和葡萄糖消耗的比速率也隨溫度升高逐漸增加。但是，當(dāng)溫度為32℃時(shí)最適于產(chǎn)甘油假絲酵母合成甘油，甘油產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率分別達(dá)到120.3g/L、0.523g/g、1.43g/(L·h)。應(yīng)用Logistic、Luedeking-Piret和Luedeking-Piret-Like方程分別對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、甘油合成動(dòng)力學(xué)和葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了模擬，獲得不同溫度下的各種動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到28-36℃范圍內(nèi)甘油分批發(fā)酵

7、過(guò)程中細(xì)胞濃度同溫度及底物濃度之間的一般關(guān)系式：X(t)=35.89(T-11.7)2exp[1.32×10-4(T+6.339)2t-2037./(T+273.13)]/1.38×104exp[-2037.3(T+273.13)]+2.61×10-3(T-11.7)2{exp[1.32×10-4(T+6.339)2t]-1}驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該模型在28-36℃范圍內(nèi)可用于預(yù)測(cè)不同溫度下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 4.當(dāng)溶氧濃度為10％時(shí)，

8、發(fā)酵過(guò)程呈現(xiàn)出“巴斯德效應(yīng)”的特征，生成的酵解代謝副產(chǎn)物維持在較高水平。在快速生長(zhǎng)階段，隨著溶氧從10％增加到60％，細(xì)胞呼吸類型由厭氧呼吸向好氧呼吸轉(zhuǎn)變，酵解代謝副產(chǎn)物依次減少。在生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體耗氧量急劇下降，此階段改變?nèi)苎跛娇梢哉{(diào)節(jié)EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間葡萄糖代謝流的合理分配：當(dāng)溶氧控制在30％時(shí)，葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生遷移，從而導(dǎo)致甘油合成途徑的代謝流增加，甘油產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率達(dá)到最高，分別為

9、120.7g/L、0.575g/g和1.69g/(L·h)；當(dāng)溶氧濃度為60％時(shí)，TCA循環(huán)可能因參與線粒體電子傳遞鏈的酶受到高濃度氧的毒害而導(dǎo)致其代謝通量減少，而葡萄糖代謝流則由HMP途徑向EMP途徑發(fā)生遷移，EMP途徑“溢流”壓力增加，糖酵解代謝副產(chǎn)物增多。 5.以EMP途徑與TCA循環(huán)中間代謝物添加作對(duì)照，確定了氨基酸的作用類型，以及具有強(qiáng)促進(jìn)作用氨基酸的作用濃度和添加時(shí)機(jī)；在適宜條件下添加L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-天

10、冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-組氨酸和L-絲氨酸等第一類氨基酸，甘油產(chǎn)量均呈顯著增加趨勢(shì)，甘油得率和增產(chǎn)率分別達(dá)到0.60g/g和16％以上。 6.在產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵過(guò)程中，添加第一類氨基酸可以提高HMP途徑、TCA循環(huán)和甘油合成途徑關(guān)鍵酶G6PDH、CIT與ctGPD的活性，而EMP途徑關(guān)鍵酶PYK的活性降低。因此，第一類氨基酸促進(jìn)甘油合成的作用機(jī)理為：第一類氨基酸添加后分解

11、成相應(yīng)酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)從而導(dǎo)致其代謝流增加，由EMP途徑下行至TCA循環(huán)的代謝通量減少；同時(shí)，HMP途徑代謝流急劇增加，必須通過(guò)促進(jìn)甘油合成來(lái)緩解其“溢流”壓力。 7.對(duì)發(fā)酵罐水平添加L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、丙酮酸和α-酮戊二酸等物質(zhì)的甘油分批發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明，L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、丙酮酸和α-酮戊二酸等物質(zhì)的添加能使葡萄糖消耗速率加快、發(fā)酵周期縮短、甘油得率提高，甘油產(chǎn)率分別達(dá)

12、到1.66g/(L·h)、1.59g/(L·h)、1.61g/(L·h)、1.54g/(L·h)和1.68g/(L·h)，分別比對(duì)照提高了25.2％、19.2％、20.8％、15.9％和26.3％；副產(chǎn)物形成主要發(fā)生在快速生長(zhǎng)階段，而甘油產(chǎn)量的顯著提高則主要發(fā)生在穩(wěn)定生長(zhǎng)期。 8.細(xì)胞內(nèi)PolyP的積累不僅與滲透壓有關(guān)，也與培養(yǎng)基中磷酸鹽含量有關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸鹽含量相同時(shí)，滲透壓越高胞內(nèi)積累的PolyP越多；當(dāng)滲透壓相同時(shí)，培

13、養(yǎng)基中磷酸鹽含量越高胞內(nèi)PolyP的積累量也越大。當(dāng)細(xì)胞由貧磷條件轉(zhuǎn)接入富磷條件下培養(yǎng)時(shí)，胞內(nèi)PolyP積累量急劇增加。特別地，胞內(nèi)積累的PolyP可以提高產(chǎn)甘油假絲酵母對(duì)強(qiáng)酸性脅迫的耐受力，從而增加細(xì)胞在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的存活率。 9.在產(chǎn)甘油假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘油過(guò)程中，富磷可以抑制HMP途徑而激活EMP途徑，糖酵解代謝加劇，因而TCA循環(huán)和甘油合成途徑的代謝流減少，甘油產(chǎn)量下降。但是，無(wú)論富磷培養(yǎng)基還是適磷培養(yǎng)基，在一定范圍內(nèi)增加其

14、滲透壓，PYK活性受到抑制，而G6PDH、CIT和ctGPD活性都增強(qiáng)，甘油產(chǎn)量提高。但是，對(duì)最高甘油產(chǎn)量而言，富磷和適磷培養(yǎng)條件均存在一個(gè)最適滲透壓。 10.當(dāng)細(xì)胞從適磷培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入貧磷培養(yǎng)基時(shí)甘油的產(chǎn)量最高，在第14h和第38h轉(zhuǎn)接時(shí)，甘油得率分別高達(dá)0.609g/g和0.614g/g，而甘油產(chǎn)率則分別為2.03g/(L·h)和2.23g/(L·h)。這為產(chǎn)甘油假絲酵母反復(fù)分批發(fā)酵法生產(chǎn)甘油提供了重要依據(jù)，同時(shí)也說(shuō)明限制發(fā)酵

15、培養(yǎng)基中磷源的濃度是其高產(chǎn)甘油的必要條件。 11.反復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞回用條件為：第一級(jí)發(fā)酵的培養(yǎng)基為適磷培養(yǎng)基(KH2PO4濃度為0.4g/L)，回用培養(yǎng)基為貧磷培養(yǎng)基(KH2PO4濃度為0.1g/L)，當(dāng)上一批次發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至10g/L以下時(shí)，將酵母細(xì)胞無(wú)菌離心后不經(jīng)洗滌全部轉(zhuǎn)接入貧磷培養(yǎng)基中繼續(xù)下一批次的發(fā)酵。在合成培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)15個(gè)細(xì)胞回用周期，甘油的平均產(chǎn)量、平均得率和平均產(chǎn)率分別達(dá)到138.7g/L、0.

16、602g/g和2.31g/(L·h)，分別增加了15.7％、15.5％和39.2％；由于回用到第15次時(shí)細(xì)胞嚴(yán)重衰退，細(xì)胞回用周期以12-14次為好。類似地，在復(fù)合培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞回用9個(gè)批次時(shí)，甘油的平均產(chǎn)量、平均得率和平均產(chǎn)率分別為145.0g/L、0.609g/g和2.42g/(L·h)，分別增加了14.5％、15.3％和37.3％；細(xì)胞以回用9次為宜。 12.與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，產(chǎn)甘油假絲酵母細(xì)胞多次回用的反復(fù)分批發(fā)酵具