產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶的純化、特性研究及其基因擴增.pdf

1、尿酸是人體嘌呤堿基分解代謝終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟排泄。體內(nèi)尿酸生成超過腎臟排泄時血清尿酸會顯著升高，造成高尿酸血癥。高尿酸血癥與痛風、心血管疾病、腫瘤裂解綜合征及腎臟疾病的引發(fā)或加劇密切相關。因此，需要開發(fā)有效的藥物來治療高尿酸血癥。當前，尿酸酶被認為是治療高尿酸血癥相關疾病的理想藥物。本項目對產(chǎn)朊假絲酵母菌及其尿酸酶進行了如下研究： 1.產(chǎn)朊假絲酵母菌的培養(yǎng)及其尿酸酶的制備、純化產(chǎn)朊假絲酵母菌(C.GM.C.C.2.1008)經(jīng)一定濃

2、度尿酸誘導培養(yǎng)后，離心收集菌體，超聲粉碎，離心，取上清即粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，尿酸酶比活性＞0.32 U/mg蛋白。在DE.AE-cellulose 52柱上，pH 8.0時此尿酸酶不被吸附，兩次層析后所得比活性達7.1 U/mg蛋白。 2.尿酸酶的特性研究Sephadex G.200凝膠過濾層析推測此尿酸酶的分子量為134.0kD。SDS.PAGE分析DEAE-cellulose 52纖維素柱層析兩次所得最高比活性尿酸酶

3、制劑(＞7.0 U/mg蛋白)，發(fā)現(xiàn)此酶只含一種約33.0 kD的多肽，MAILDI-TOF-MS分析最高比活性樣品沒有檢測到單一肽鏈，而豐度最高成分為67.7 kD，次高成分為131.4 kD。25+0.5℃時，此尿酸酶最適pH接近8.8，在pH 7.4時可保留50％以上活性，37℃時4 h內(nèi)穩(wěn)定，米氏常數(shù)為(32.8±3.1)μmol/L(n=lO)。抑制劑譜測定發(fā)現(xiàn)：除腺苷、鳥苷和肌苷對該尿酸酶無抑制作用外，氧嗪酸鉀的抑制常數(shù)為(

4、1.1±0.1)μmol/L(n=3)，黃嘌呤的抑制常數(shù)為(4.8±0.2) μmol/L(n=3)，鳥嘌呤的抑制常數(shù)為(37.9±4.2)μmol/L(n=3)，次黃嘌呤的抑制常數(shù)為(500.0±60.0)μmol/L(n=3)，腺嘌呤的抑制常數(shù)為(748.9±82.0)μmol/L(n=3)，別嘌呤醇的抑制常數(shù)為(927.6±95.0)μmol/L(n=3)。用蒸餾水透析后失活90％以上，且隨后加NaCl處理后酶活性不能恢復。1.0

5、mmol/L 碘乙酸30 min內(nèi)可使該尿酸酶完全失活，1.0 mmol/L 的Cu2+和Fe3+ 對此酶有明顯抑制作用。這些結(jié)果表明此尿酸酶需通過分子工程改造才能用作治療高尿酸血癥相關疾病的藥物。 3.產(chǎn)朊假絲酵母菌尿酸酶基因的PCR擴增、測序利用試劑盒提取出產(chǎn)朊假絲酵母基因組DNA，設計特異引物，優(yōu)化PCR.條件，最終擴增出大小與我們預計相符的DNA片段。對此片段進行膠回收純化后送去測序，將正、反向測序結(jié)果比對拼接得到最后的