釀酒酵母以甘油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、化石能源作為一種有限的不可再生資源，在人類持續(xù)、大量開采使用下，必然面臨枯竭，為從根本上解決化石能源危機(jī)，生物乙醇作為替代能源得到了蓬勃發(fā)展。由于目前國(guó)際糧食價(jià)格飛漲，用糧食生產(chǎn)乙醇會(huì)引發(fā)糧食危機(jī)。與糧食吃緊形成鮮明對(duì)比的是生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生10％的主要副產(chǎn)物甘油，然而這些過(guò)量的甘油卻會(huì)成為環(huán)境隱患。這些甘油的一個(gè)可能的應(yīng)用前景是將其作為微生物生長(zhǎng)所必需的碳源以生產(chǎn)高附加值的化工產(chǎn)品。
　　 以甘油為底物生產(chǎn)生物乙醇，能同

2、時(shí)解決糧食緊張和甘油過(guò)剩兩個(gè)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中已經(jīng)構(gòu)建了編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因GPD1、GPD2雙缺失的LGE4酵母工程菌株，在利用甘油為碳源生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中不會(huì)有副產(chǎn)物甘油產(chǎn)生，為本課題研究建立了基礎(chǔ)。
　　 由于LGE4菌株中甘油代謝支路被阻斷，細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡遭到了破壞--產(chǎn)生過(guò)剩的NADH，嚴(yán)重影響菌株生長(zhǎng)狀況。為此本課題在LGE4菌株中表達(dá)編碼NADH氧化酶的noxE基因，構(gòu)建出菌株LGE4-N。

3、NADH氧化酶可以在有氧的條件下氧化NADH生成H2O，維持胞內(nèi)氧化還原平衡，從而改善了菌株生長(zhǎng)狀況。
　　 在LGE4-N生長(zhǎng)改善的基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)編碼甘油脫氫酶的GCY1基因以及編碼磷酸二羥丙酮的DAK1、DAK2基因，這些基因的編碼產(chǎn)物催化甘油到磷酸二羥丙酮的代謝，是以甘油為底物生產(chǎn)乙醇的重要環(huán)節(jié)。首先分別在YCplac33和YEplac195質(zhì)粒上構(gòu)建用PGK1的啟動(dòng)子表達(dá)GCY1、DAK1、DAK2的質(zhì)粒；然后在整合了n