釀酒酵母高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵體系振蕩行為.pdf

1、超高濃度(Very high gravity，VHG)發(fā)酵可以顯著提高發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度，節(jié)省精餾能耗，同時(shí)減少廢糟液量。雖然VHG發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)在批式乙醇發(fā)酵中得到應(yīng)用，但是批式發(fā)酵輔助操作時(shí)間長和人工成本高的特點(diǎn)，使其難以滿足燃料乙醇大規(guī)模生產(chǎn)的需求，因此研究開發(fā)VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵技術(shù)具有十分重要的意義。然而在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，包括殘?zhí)?、乙醇和生物量濃度等發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)

2、長周期大振幅的振蕩行為，不僅嚴(yán)重影響系統(tǒng)的乙醇發(fā)酵性能，而且不利于下游精餾裝置的穩(wěn)定運(yùn)行。本研究通過過程工程策略、代謝輪廓及轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)誘發(fā)S.cerevisiae VHG連續(xù)乙醇發(fā)酵過程振蕩行為的機(jī)理進(jìn)行了探討。
　　VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞受乙醇抑制和滲透壓脅迫，且這兩個(gè)脅迫因素是偶聯(lián)的。通過向低糖(Low gravity，LG)培養(yǎng)基中添加乙醇，使乙醇抑制與滲透壓脅迫解偶聯(lián)，考察了乙醇抑制對(duì)連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)振蕩行為的影響

3、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LG培養(yǎng)基中添加30和50 g/L乙醇后，能夠使穩(wěn)態(tài)運(yùn)行的連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)生振蕩行為，而且高濃度乙醇引發(fā)的振蕩行為更顯著，當(dāng)LG培養(yǎng)基中停止添加乙醇時(shí)，連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)逐漸恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。在VHG連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)偶聯(lián)氮?dú)鈿馓?，降低發(fā)酵液中自產(chǎn)乙醇濃度，可以有效弱化振蕩行為。當(dāng)添加乙醇濃度達(dá)到70 g/L時(shí)，酵母細(xì)胞生長和乙醇發(fā)酵幾乎被完全抑制。通過向LG培養(yǎng)基中添加S.cerevisiae不能代謝的木糖，模擬VHG連續(xù)發(fā)酵體系的滲透壓環(huán)境

4、，研究酵母細(xì)胞滲透壓脅迫對(duì)系統(tǒng)振蕩行為的影響，結(jié)果表明雖然滲透壓脅迫對(duì)酵母細(xì)胞生長有一定的抑制作用，但不能誘發(fā)乙醇連續(xù)發(fā)酵體系的振蕩行為。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用是誘發(fā)VHG連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)振蕩行為的主要原因。
　　考察了菌種乙醇耐受性差異和培養(yǎng)基組成對(duì)VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)振蕩行為的影響，發(fā)現(xiàn)高乙醇耐性菌株S.cerevisiae BHL01和S.cerevisiae4126的VHG連續(xù)發(fā)酵體系均呈現(xiàn)振蕩行為，而低乙

5、醇耐性菌株S.cerevisiae288c發(fā)酵體系卻維持在高殘?zhí)堑鸵掖紳舛鹊臄M穩(wěn)態(tài)。在S.cerevisiae4126 VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中，培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)豐富的酵母粉和蛋白胨時(shí)，能夠觀察到周期性振蕩行為，而使用合成培養(yǎng)基或停止通氣時(shí)只能觀察到類似阻尼振蕩的行為，系統(tǒng)最終維持高殘?zhí)堑鸵掖紳舛鹊臄M穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，進(jìn)一步表明了VHG連續(xù)發(fā)酵體系中乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用是誘發(fā)周期性振蕩行為的主要因素，而且這種振蕩行為是營養(yǎng)和能量依賴的過程，

6、并與菌株的乙醇耐受性有關(guān)。利用高乙醇耐性菌株S.cerevisiae BHL01進(jìn)行VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵并偶聯(lián)尾氣循環(huán)氣提，可以使發(fā)酵液中殘?zhí)墙抵?.10 g/L以下，乙醇濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到110.87 g/L和2.99g/L/h，為VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵技術(shù)開發(fā)提供了新思路。
　　建立了以冷甲醇法和冷氯仿-甲醇-緩沖液法進(jìn)行酵母細(xì)胞代謝淬滅和胞內(nèi)代謝物提取及以乙腈和20 mM乙酸銨溶液為流動(dòng)相的選擇反應(yīng)掃描監(jiān)測模式LC-MS/MS

7、分析方法。對(duì)完整振蕩周期關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)取樣，分析了糖酵解和下游乙醇生成途徑關(guān)鍵代謝物及關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中，糖酵解耗能階段代謝物GLC、G6P及F6P濃度變化與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及己糖激酶編碼基因HXT1和HXT3及HXK2和GLK1表達(dá)水平呈現(xiàn)V型，當(dāng)發(fā)酵體系中乙醇變化速率最大時(shí)達(dá)到最低值，表明酵母細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用受到發(fā)酵體系中乙醇變化速率的調(diào)控。然而產(chǎn)能階段代謝物GAP、G3P及PYR與磷酸果糖激酶催化反應(yīng)

8、產(chǎn)物FBP的濃度變化呈現(xiàn)N型，與耗能階段代謝物濃度變化存在1/4周期差，表明酵母細(xì)胞胞內(nèi)存在糖酵解振蕩，且受到磷酸果糖激酶的調(diào)控。丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶是酵母乙醇發(fā)酵關(guān)鍵酶，其編碼基因PDC1和ADH1的表達(dá)水平也呈現(xiàn)V型，表明乙醇生成受發(fā)酵體系中乙醇變化速率的調(diào)控。
　　TCA循環(huán)順時(shí)針途徑代謝物AKG與SUC的濃度變化呈現(xiàn)倒S型，而逆時(shí)針途徑代謝物ACCOA、OAA、FUM和MAL濃度變化則呈現(xiàn)N型，且與糖酵解途徑代謝物FB

9、P、GAP、G3P和PYR變化同步，表明VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中酵母細(xì)胞TCA循環(huán)不是閉合的，而是以逆時(shí)針途徑為主。胞內(nèi)CIT濃度達(dá)到10-20μmol/g(DCW)，明顯高于TCA循環(huán)其他代謝物濃度，且過氧化物酶體中檸檬酸合酶編碼基因CIT2表達(dá)量明顯高于線粒體中檸檬酸合酶編碼基因CIT1，表明VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中酵母細(xì)胞內(nèi)存在乙醛酸循環(huán)通量。VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中，胞外甘油平均濃度高達(dá)11.5 g/L，甘油-3-磷酸脫氫酶編碼

10、基因GPD1表達(dá)量明顯高于氧化還原調(diào)控基因GPD2，且與發(fā)酵體系中殘?zhí)菨舛茸兓厔菀恢?，表明酵母?xì)胞甘油合成主要用于調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓平衡。胞內(nèi)TRE濃度達(dá)到40-80μmol/g(DCW)，且與發(fā)酵體系中乙醇濃度的變化相關(guān)，海藻糖合成基因表達(dá)量明顯高于糖原合成基因，表明海藻糖是VHG振蕩過程中酵母細(xì)胞合成的主要抗逆物質(zhì)。
　　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，酵母細(xì)胞核糖體蛋白、核苷酸、氨基酸、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁以及輔酶因子等合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)均呈現(xiàn)