釀酒酵母JJJ1基因敲除提高乙酸耐性和纖維乙醇發(fā)酵性能.pdf

1、木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理過程中會產(chǎn)生各種對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生長與發(fā)酵有影響的抑制物，如弱酸、呋喃衍生物和酚類化合物等。乙酸是半纖維素降解產(chǎn)生的一種主要抑制物，未解離的乙酸可以通過質(zhì)膜簡單擴散進入酵母細胞，引起胞內(nèi)酸化，從而抑制細胞代謝與生長，降低纖維乙醇生產(chǎn)效率。因此，釀酒酵母耐乙酸分子機制的揭示和闡明，對合理設(shè)計發(fā)酵條件，指導(dǎo)構(gòu)建適應(yīng)較高濃度乙酸環(huán)境、提高纖維乙醇發(fā)酵效率的釀酒酵母工程菌株均具重要

2、的意義。
　　在課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母細胞在含有多種抑制物的木質(zhì)纖維素水解液中生長時，JJJ1基因的表達量出現(xiàn)下調(diào)。為了弄清在纖維素水解液中酵母細胞面對抑制物時JJJ1的作用，本文首先對釀酒酵母菌株BY4741及其基因敲除菌株BY△JJJ1的多種脅迫耐性進行比較，發(fā)現(xiàn)BY△JJJ1對甲酸和乙酸的脅迫耐性顯著增強。在5.5g/L乙酸、1.2g/L甲酸或各種抑制物混合的纖維素水解液(3.0g/L乙酸、0.2g/L甲酸、1.1g/

3、L糠醛和0.2g/L5羥甲基糠醛)中，發(fā)酵開始和結(jié)束時間較親株均提前了17h以上。JJJ1敲除對工業(yè)菌株YJSH1乙酸耐性提高也具有相同的效果。通過對乙酸相關(guān)的生理生化因子的分析，發(fā)現(xiàn)乙酸脅迫下，BY JJJ1細胞內(nèi)的乙酸積累較BY4741減少了7.8％以上，海藻糖增加了37.6％以上;同時，細胞膜中長鏈脂肪酸的比例增加了12.3％，麥角固醇含量減少了12％，細胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT活性也有所增加。利用RNA測序技術(shù)

4、對野生型菌株BY4741和敲除菌BY△JJJ1的轉(zhuǎn)錄組進行分析，結(jié)果顯示在BY△JJJ1菌株中約有218個基因表達量發(fā)生了較大變化。對這些基因在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝和細胞膜上一些轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因表達量下調(diào);同時，細胞壁功能和核糖體相關(guān)基因表達量上調(diào)。結(jié)合兩個菌株若干生理生化指標(biāo)差異分析，提示JJJ1敲除后，細胞壁有關(guān)蛋白的表達量升高，細胞壁重構(gòu)更加強化，減少了進入細胞內(nèi)的乙酸量，從而減少了乙酸對細胞的毒害作