遺傳改良釀酒酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、能源危機(jī)和全球氣候變暖，導(dǎo)致人們迫切需要低成本的可再生能源。目前，木質(zhì)纖維素被認(rèn)為可以用來生產(chǎn)生物燃料。成功利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇取決于對(duì)生物質(zhì)水解的六碳糖和五碳糖的高效轉(zhuǎn)化。已有大量關(guān)于工程酵母利用木糖發(fā)酵乙醇的報(bào)道，但是和葡萄糖發(fā)酵相比，這些菌株對(duì)木糖的利用效率以及乙醇的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?。因此，?duì)釀酒酵母進(jìn)行遺傳改良進(jìn)行高效木糖發(fā)酵，很有必要。
　　本研究中克隆了酵母木糖發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵基因XYL1，XYL2和XKS1，構(gòu)建到組成型

2、表達(dá)載體pPYPGE15，并成功轉(zhuǎn)化到Ura3營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母PY001中。對(duì)得到的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶活性的測(cè)定，酵母生長量以及木糖發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。比較了XYL1和XYL2不同表達(dá)順序、融合表達(dá)XYL1-XYL2時(shí)酶活性的差異以及其對(duì)利用木糖發(fā)酵乙醇效率的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)先轉(zhuǎn)錄XYL1的菌株P(guān)Y001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1在所有時(shí)間段均表現(xiàn)出XYL1酶活性高于PY001/pYPGE15XYL2

3、XYL1XKS1，在培養(yǎng)48h時(shí)達(dá)到最高峰為0.027U/mg。優(yōu)先表達(dá)XYL2的菌株P(guān)Y001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1表現(xiàn)出最高的XYL2的酶活性，在培養(yǎng)48h達(dá)到1.64U/mg?？梢酝茢嗷蛟谳d體的轉(zhuǎn)錄順序會(huì)影響蛋白水平的表達(dá)，優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)量較高。
　　使用連接肽(G4S1)1融合表達(dá)XYL1和XYL2蛋白時(shí)，酶活性均無明顯提高，使用連接肽(G4S1)3時(shí)，XYL1的活性與對(duì)照菌株相比無明顯變化，而XY

4、L2的活性提高了11倍左右。說明在融合表達(dá)XYL1-XYL2時(shí)，XYL1肽段的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而XYL2肽段活性不受影響。
　　以1％木糖為唯一碳源進(jìn)行限氧發(fā)酵時(shí)，PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1和PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1可以利用木糖進(jìn)行緩慢生長，在培養(yǎng)72h后OD/600nm達(dá)到0.95左右，但乙醇產(chǎn)量太低而無法檢測(cè)。以1％木糖和2％葡萄糖為底物進(jìn)行共發(fā)酵，PY001/pYPGE15X