人BDNF基因克隆及其基因工程細胞對體外小鼠螺旋神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的:神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素4/5(NT4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)素-6(NT-6)等幾種.它們具有高度同源性.實驗證明神經(jīng)因子家族中的BDNF對神經(jīng)元有支持存活、增進代謝、有助分化和再生等作用.對于外周聽覺神經(jīng)系統(tǒng),BDNF、NT3、NGF等表達水平的改變與聽神經(jīng)末梢的發(fā)育、分

2、布有密切的關系,貫穿于從聽板形成至corti器毛細胞與傳入、傳出聽神經(jīng)末梢間建立突觸關系的全過程.該文的研究內(nèi)容是克隆BDNF基因并插入到pcDNA3.1(-)中,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到COS7細胞后檢測其表達,轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)后檢測其上清對體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞活力的影響.方法:1.腦源性神經(jīng)生長因子BDNF基因克隆及其表達載體構(gòu)建.首先抽提人胚腦總mRNA,以RT-PCR擴增出BDNF基因片段并構(gòu)建測序載體,測序證實克隆基

3、因序列后將BDNF基因插入真核表達載體pcDNA3.1(-)中,電泳證實.2.BDNF基因工程細胞模型的建立及活性檢測.首先將載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到無BDNF背景的COS7細胞中,以免疫組織化學檢測證明其可以表達出BDNF產(chǎn)物,再轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)干細胞,取上清液加到螺旋神經(jīng)節(jié)細胞培養(yǎng)基中,通過MTT檢測其表達產(chǎn)物對細胞活力的影響.結(jié)果:該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1(-)-BDNF可以在COS7細胞中持續(xù)表達,其產(chǎn)物可有效保