沙利度胺對體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細(xì)胞增殖活性、膠原合成及MMP-1、TIMP-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:真皮成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層中最重要的細(xì)胞，它在分泌以及合成纖維和細(xì)胞外基質(zhì)（以膠原為主）中飾演重要角色，這對于正常真皮結(jié)締組織的構(gòu)成、皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和真皮纖維化疾病等的發(fā)生具有極其重要的意義。皮膚纖維化是因?yàn)檎嫫こ衫w維細(xì)胞活動反常致使以膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在皮膚組織中過量堆積，很難被機(jī)體降解的異常增生現(xiàn)象。纖維化性疾病包括累及多種器官的疾病，例如間質(zhì)性肺纖維化、硬皮病、肝纖

2、維化（肝硬化）、腎臟纖維化等，雖然它們的發(fā)病機(jī)制大多數(shù)不明以及臨床表現(xiàn)也各有不同，但它們有一個(gè)共同特點(diǎn)就是受損組織中細(xì)胞外基質(zhì)（以膠原為主）過度沉積。越來越多的研究證明沙利度胺具有抑制動物纖維化模型或人肺、肝、心等器官纖維化的作用。如外文文獻(xiàn)研究報(bào)道[1]，沙利度胺可以通過抑制肺組織成纖維細(xì)胞的增殖以及減少膠原的合成，從而起到抑制小鼠肺間質(zhì)纖維化的作用。雖然近年來不斷有關(guān)于沙利度胺對動物或人肺、滑膜、骨髓等成纖維細(xì)胞的研究報(bào)道，但沙利度

3、胺對正常人皮膚成纖維細(xì)胞有什么樣影響尚未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人正常真皮成纖維細(xì)胞，觀察沙利度胺對體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細(xì)胞的增殖情況、膠原合成以及表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的影響。目的在初步探討沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制，希望為其臨床應(yīng)用于皮膚纖維化性疾病的可能性以及更進(jìn)一步的研究提供可靠的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過酶聯(lián)合消化法

4、體外培養(yǎng)人正常真皮成纖維細(xì)胞，并利用免疫組化法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，取第五代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　2、將不同濃度的沙利度胺加入體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細(xì)胞，待沙利度胺作用24小時(shí)后，通過MTT比色法檢測不同濃度組沙利度胺（103～10-11mol/L，共9組）對人正常真皮成纖維細(xì)胞增殖活性的影響，然后篩查出沙利度胺對成纖維細(xì)胞作用的有效濃度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組所用。
　　3、依據(jù)MTT結(jié)果分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，通過堿水解法檢測沙利度胺作

5、用24小時(shí)后人正常真皮成纖維細(xì)胞羥脯氨酸的含量，間接反應(yīng)膠原合成的情況。
　　4、依據(jù)MTT結(jié)果分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，通過熒光定量PCR法檢測沙利度胺對正常人真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1mRNA，TIMP-1mRNA的影響。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的可采用單因素方差分析，否則按照非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義。
　　6、實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
　　結(jié)果:
　　1、MTT結(jié)果顯示:沙利度胺在一定濃度（10-3～10-6mol/L）范圍內(nèi)能抑制成纖維細(xì)胞體外增殖，各濃度實(shí)驗(yàn)組分別與空白對照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，其中10-3與10-4mol/L兩濃度組抑制最明顯，與其它兩組(10-5與10-6mol/L兩組)相比有顯著差異(P＜0.05)。而10-7～10-11mol/L5個(gè)濃

7、度組與對照組相比雖有輕微變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2、沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量的影響:
　　沙利度胺在各個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度（10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）作用細(xì)胞24小時(shí)后，上清液中羥脯氨酸的含量較對照組均降低，經(jīng)方差分析各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中10-4mol/L組羥脯氨酸含量最低，與其它實(shí)驗(yàn)組對比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

8、>　　3、PCR法檢測沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1mRNA的影響:
　　沙利度胺不同濃度實(shí)驗(yàn)組(10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)處理成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，MMP-1mRNA表達(dá)均有不同程度的升高，經(jīng)方差分析，各實(shí)驗(yàn)組分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且四個(gè)實(shí)驗(yàn)組兩兩分別比較，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、PCR法檢測沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)TIM

9、P-1mRNA的影響:
　　沙利度胺不同實(shí)驗(yàn)組（濃度分別為10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）干預(yù)成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，可見TIMP-1mRNA表達(dá)均有不同程度降低，經(jīng)方差分析，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩對比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究證實(shí)沙利度胺在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制人正常真皮成纖維細(xì)胞的增殖。
　　2、沙利度胺在一定濃