沙利度胺對體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細胞增殖活性、膠原合成及MMP-1、TIMP-1表達的影響.pdf

1、目的:真皮成纖維細胞是皮膚真皮層中最重要的細胞，它在分泌以及合成纖維和細胞外基質（以膠原為主）中飾演重要角色，這對于正常真皮結締組織的構成、皮膚創(chuàng)傷修復和真皮纖維化疾病等的發(fā)生具有極其重要的意義。皮膚纖維化是因為真皮成纖維細胞活動反常致使以膠原蛋白為主要成分的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)在皮膚組織中過量堆積，很難被機體降解的異常增生現(xiàn)象。纖維化性疾病包括累及多種器官的疾病，例如間質性肺纖維化、硬皮病、肝纖

2、維化（肝硬化）、腎臟纖維化等，雖然它們的發(fā)病機制大多數不明以及臨床表現(xiàn)也各有不同，但它們有一個共同特點就是受損組織中細胞外基質（以膠原為主）過度沉積。越來越多的研究證明沙利度胺具有抑制動物纖維化模型或人肺、肝、心等器官纖維化的作用。如外文文獻研究報道[1]，沙利度胺可以通過抑制肺組織成纖維細胞的增殖以及減少膠原的合成，從而起到抑制小鼠肺間質纖維化的作用。雖然近年來不斷有關于沙利度胺對動物或人肺、滑膜、骨髓等成纖維細胞的研究報道，但沙利度

3、胺對正常人皮膚成纖維細胞有什么樣影響尚未見報道。
　　本實驗通過體外培養(yǎng)人正常真皮成纖維細胞，觀察沙利度胺對體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細胞的增殖情況、膠原合成以及表達基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的影響。目的在初步探討沙利度胺對人正常真皮成纖維細胞的作用機制，希望為其臨床應用于皮膚纖維化性疾病的可能性以及更進一步的研究提供可靠的理論依據。
　　方法:
　　1、通過酶聯(lián)合消化法

4、體外培養(yǎng)人正常真皮成纖維細胞，并利用免疫組化法對細胞進行鑒定，取第五代細胞進行試驗。
　　2、將不同濃度的沙利度胺加入體外培養(yǎng)的人正常真皮成纖維細胞，待沙利度胺作用24小時后，通過MTT比色法檢測不同濃度組沙利度胺（103～10-11mol/L，共9組）對人正常真皮成纖維細胞增殖活性的影響，然后篩查出沙利度胺對成纖維細胞作用的有效濃度，為后續(xù)實驗分組所用。
　　3、依據MTT結果分為實驗組和對照組，通過堿水解法檢測沙利度胺作

5、用24小時后人正常真皮成纖維細胞羥脯氨酸的含量，間接反應膠原合成的情況。
　　4、依據MTT結果分為實驗組和對照組，通過熒光定量PCR法檢測沙利度胺對正常人真皮成纖維細胞表達MMP-1mRNA，TIMP-1mRNA的影響。
　　5、統(tǒng)計學分析:采用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行統(tǒng)計處理，實驗數據首先經正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的可采用單因素方差分析，否則按照非參數檢驗中的Mann-Whitney檢驗，P＜0.05有統(tǒng)

6、計學意義。
　　6、實驗步驟嚴格按照說明書進行。
　　結果:
　　1、MTT結果顯示:沙利度胺在一定濃度（10-3～10-6mol/L）范圍內能抑制成纖維細胞體外增殖，各濃度實驗組分別與空白對照組相比均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各實驗組間兩兩比較，其中10-3與10-4mol/L兩濃度組抑制最明顯，與其它兩組(10-5與10-6mol/L兩組)相比有顯著差異(P＜0.05)。而10-7～10-11mol/L5個濃

7、度組與對照組相比雖有輕微變化，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2、沙利度胺對人正常真皮成纖維細胞上清液中羥脯氨酸含量的影響:
　　沙利度胺在各個實驗濃度（10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）作用細胞24小時后，上清液中羥脯氨酸的含量較對照組均降低，經方差分析各實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中10-4mol/L組羥脯氨酸含量最低，與其它實驗組對比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

8、>　　3、PCR法檢測沙利度胺對人正常真皮成纖維細胞表達MMP-1mRNA的影響:
　　沙利度胺不同濃度實驗組(10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)處理成纖維細胞24小時后，MMP-1mRNA表達均有不同程度的升高，經方差分析，各實驗組分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且四個實驗組兩兩分別比較，差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4、PCR法檢測沙利度胺對人正常真皮成纖維細胞表達TIM

9、P-1mRNA的影響:
　　沙利度胺不同實驗組（濃度分別為10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）干預成纖維細胞24小時后，可見TIMP-1mRNA表達均有不同程度降低，經方差分析，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且各實驗組之間兩兩對比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、本研究證實沙利度胺在一定濃度范圍內可以抑制人正常真皮成纖維細胞的增殖。
　　2、沙利度胺在一定濃