Wnt5a在白血病中的表達及其啟動子區(qū)域甲基化的研究.pdf

1、目的： Wnt途徑是一種對控制胚胎發(fā)育起重要作用的信號傳導(dǎo)途徑，而其不恰當?shù)鼗罨瘏⑴c人類多種腫瘤的發(fā)生。多項腫瘤相關(guān)研究顯示，Wnt5a是一個良好的腫瘤侵襲和預(yù)后標志物，令人費解的是，它在不同腫瘤中具有截然不同的表達水平，但確切關(guān)系和作用機制不明，特別是它與白血病發(fā)生的關(guān)系和作用少見報道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a在少數(shù)髓系白血病病例中表達下調(diào)或缺失，用Wnt5a條件培養(yǎng)液處理白血病細胞株K562，可抑制其惡性增值。本研究擬

2、觀察Wnt5a表達缺失在白血病中是否是普遍現(xiàn)象，以及初步觀察表達缺失的分子機制，進一步證明Wnt5a表達缺失是否與白血病發(fā)生有關(guān)。該研究首先發(fā)現(xiàn)Wnt5a在白血病病例和白血病細胞株中表達缺失，進而探討了Wnt5a表達下調(diào)的原因，為深入認識Wnt5a在白血病發(fā)生中的機制打下堅實基礎(chǔ)，通過研究有望為白血病診斷提供新的腫瘤標志物和基因治療靶點。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR方法檢測27例正常人骨髓標本和10例臍帶血CD34+細

3、胞，以及K562、Jurkat、HL-60、U937白血病細胞株中Wnt5a的表達。 2.應(yīng)用RT-PCR方法檢測68例白血病患者和35例完全緩解白血病患者骨髓標本中Wnt5a的表達。 3.應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測正常人、白血病病例及白血病細胞株中Wnt5a基因啟動子甲基化的水平。 4.用去甲基化試劑Adc處理白血病細胞株后檢測Wnt5a的表達水平和Wnt5a基因啟動子甲基化的水平。 5.用

4、去甲基化試劑Adc處理白血病細胞株4d，并以臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)和總細胞計數(shù)，繪制生長曲線并進行統(tǒng)計學分析。 6.流式細胞儀分析去甲基化試劑Adc處理的K562細胞4d后細胞周期的變化情況，并與對照組細胞進行比較。 結(jié)果： 1.27例正常入骨髓標本中有24例陽性表達Wnt5a，陽性率為88.9％(24/27)，10例CD34+細胞全部表達Wnt5a，白血病細胞株K562、HL-60、U937均不表達Wnt5a

5、，Jurkat細胞弱陽性表達Wnt5a。 2.68例白血病患者骨髓標本中有7例Wnt5a陽性表達，陽性率為：10.1％，35例完全緩解白血病患者骨髓標本中有23例陽性表達Wnt5a，陽性率為：65.7％。 3.應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)檢測正常人Wnt5a基因啟動子甲基化的水平，發(fā)現(xiàn)沒有甲基化；3株白血病細胞株中K562、HL-60、U937細胞的Wnt5a基因啟動子均發(fā)生了甲基化，Jurkat細胞發(fā)生了部分甲基化

6、，而白血病完全緩解病例的Wnt5a基因啟動子發(fā)生去甲基化。 4.用去甲基化試劑Adc處理白血病細胞株K562、Jurkat、HL-60、U937后均檢測到Wnt5a的表達水平上調(diào)，且Wnt5a基因啟動子發(fā)生去甲基化。 5.用去甲基化試劑Adc處理白血病細胞株K5624d，并以臺盼藍()色進行活細胞計數(shù)和總細胞計數(shù)，繪制生長曲線并進行統(tǒng)計學分析，生長曲線顯示去甲基化試劑Adc明顯抑制K562細胞的增殖，但臺盼藍染色結(jié)果顯示

7、未影響到細胞間存活率。 6.用流式細胞儀分析Adc處理K562細胞4d后的細胞周期變化情況，并與對照組細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)細胞周期的G2期增高了3倍，表明Adc處理后， K562增殖的細胞周期被阻滯在G2期。 結(jié)論： 1.RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在88.9％(24/27)的正常人骨髓中陽性表達，在100％(10/10)的CD34+細胞中陽性表達，在白血病細胞株中表達缺失，在白血病患者骨髓標本中僅有13.

8、2％(9/68)陽性表達，而在完全緩解的白血病患者骨髓標本中陽性表達率升高達到65.7％(23/35)，是白血病患者的5倍。提示W(wǎng)nt5a表達缺失可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。 2.MSP法檢測部分白血病病例和4株白血病細胞均發(fā)現(xiàn)Wnt5a基因啟動子發(fā)生甲基化，而正常人和完全緩解的白血病病例Wnt5a基因啟動子沒有發(fā)生甲基化。提示W(wǎng)nt5a基因啟動子發(fā)生甲基化是Wnt5a表達缺失的原因之一。 3.用去甲基化試劑Adc處理白血病

9、細胞株后，檢測發(fā)現(xiàn)Wnt5a基因啟動子發(fā)生去甲基化，Wnt5a表達上調(diào)，與對照組相比：細胞生長明顯受到抑制，細胞周期G2期明顯增高，提示Adc可能將K562細胞周期阻滯在G2期，使細胞不能進行正常的有絲分裂，從而抑制了細胞的增殖。 以上研究提示，Wnt5a在白血病病例中普遍表達缺失，而在治療緩解病例中表達恢復(fù)，白血病細胞中Wnt5a啟動子甲基化致表達沉默是Wnt5a表達缺失的分子機制，Wnt5a在白血病病例中發(fā)揮抑癌基因的作用，