紅景天苷干預(yù)細(xì)胞衰老的分子機(jī)制及其防治骨質(zhì)疏松活性的研究.pdf

1、紅景天（Rhodiola）為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，是珍稀藥用植物之一，被譽(yù)為“高原人參”。大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察表明，紅景天具有多種藥理活性，包括增加機(jī)體免疫力、刺激神經(jīng)系統(tǒng)、抗應(yīng)激反應(yīng)、抗疲勞、抗缺氧等，具有典型的“適應(yīng)原樣”作用。紅景天苷是紅景天的主要活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明紅景天苷能有效延長果蠅壽命，有效下調(diào)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠體內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物（AGE）水平，并顯著改善小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，展

2、現(xiàn)出良好的抗衰老效應(yīng)。本研究中，我們采用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早熟性衰老模型、復(fù)制性衰老及DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型，從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探討了紅景天苷干預(yù)衰老的效應(yīng)機(jī)制。
　　 衰老的自由基學(xué)說是一個(gè)經(jīng)典的衰老理論，研究表明紅景天苷是一個(gè)抗氧化劑，但其抗氧化活性與其干預(yù)衰老的作用尚缺乏直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們首先應(yīng)用亞致死量的H2O2作用于年輕的2BS細(xì)胞（PD28）建立早熟性細(xì)胞衰老模型，同時(shí)采用紅景天苷進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明紅景天苷能

3、顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的衰老樣改變，包括細(xì)胞形態(tài)、SA-β-Gal染色陽性率、G1期阻滯以及衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16等的表達(dá)上調(diào)。紅景天苷的這種保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性，在5μM劑量下效果最佳。在該模型中，紅景天苷的抗氧化活性也得到了證實(shí)，該化合物能顯著下調(diào)模型細(xì)胞內(nèi)ROS含量，5μM劑量下與2mM的NAC效果相當(dāng)，同時(shí)下調(diào)MDA含量，對總SOD活力及蛋白表達(dá)也有一定的上調(diào)作用。與此同時(shí)，采用復(fù)制衰老性細(xì)胞衰老模型發(fā)現(xiàn)，紅景

4、天苷能顯著延遲2BS細(xì)胞的復(fù)制性衰老，延長2BS細(xì)胞代齡8PD左右，對衰老表型的影響與其在H2O2模型中的相似。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，在上述兩個(gè)模型中采用NAC對比研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷降調(diào)節(jié)p53、p21部分依賴于ROS水平的下降，尚有ROS非依賴機(jī)制。這可能的原因是紅景天苷能直接調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)的相關(guān)分子表達(dá)進(jìn)而改變由此誘導(dǎo)的衰老樣表型。為此，我們采用一種具有強(qiáng)烈DNA斷裂活性的烯二炔類抗腫瘤抗生素--力達(dá)霉素（0.1 nM）作用于年輕2

5、BS細(xì)胞，在分子水平上，紅景天苷能顯著減少LDM誘導(dǎo)的DNA損傷程度--γ-H2AX水平，并且依然能逆轉(zhuǎn)LDM引起的p53、p21表達(dá)上調(diào)；同時(shí)，對力達(dá)霉素誘導(dǎo)年輕2BS細(xì)胞產(chǎn)生的衰老樣表型也有一定的逆轉(zhuǎn)作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)紅景天苷能顯著促進(jìn)2BS細(xì)胞內(nèi)線粒體的增殖，這可能是紅景天苷發(fā)揮延緩衰老作用的新機(jī)制，并且其效果與相同劑量的白藜蘆醇相當(dāng)，但其機(jī)制可能不同于白藜蘆醇，SIRT1抑制劑并不能抑制紅景天苷的促線粒體增殖效應(yīng)。這些研究表明

6、紅景天苷具有良好的延緩衰老的效應(yīng)，該效應(yīng)一方面與其抗氧化活性相關(guān)，一方面也與直接調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)相關(guān)。
　　 此外，骨質(zhì)疏松是一種常見的與增齡密切相關(guān)的代謝性骨病，通過改善骨質(zhì)代謝、增強(qiáng)成骨細(xì)胞的作用，最終達(dá)到恢復(fù)患者骨量水平為目的的治療方案日益受到人們的重視。骨形態(tài)形成因子2（bmp2）基因的表達(dá)對于成骨細(xì)胞活性及其分化有著關(guān)鍵作用。我們通過一種以bmp2為靶點(diǎn)的新型抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能有效上調(diào)小鼠顱骨細(xì)胞

7、MC3T3-E1中BMP2的表達(dá)效應(yīng)，表明該化合物可能具有一定的促骨形成能力。為證實(shí)紅景天苷的這一效應(yīng)，我們首先采用大鼠成骨細(xì)胞（ROB）和人成骨樣細(xì)胞MG63研究了紅景天苷對成骨細(xì)胞的影響，測定了紅景天苷對成骨細(xì)胞增殖以及成骨性標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）和膠原合成的影響；進(jìn)而采用雌性大鼠去勢模型，觀察了紅景天苷對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型的作用。體外研究表明，紅景天苷作用于ROB細(xì)胞后，能顯著促進(jìn)成骨性的骨形成：MTT試驗(yàn)表明紅景天苷促進(jìn)細(xì)

8、胞增殖達(dá)30％左右，ALP活性測定表明經(jīng)紅景天苷作用后其活性上調(diào)30％，3H-脯氨酸摻入試驗(yàn)表明紅景天苷作用成骨細(xì)胞后其膠原合成增加1倍左右。在MG63細(xì)胞中我們觀察到了相似的結(jié)果。此外，real-time RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，MG63細(xì)胞內(nèi)bmp2的mRNA表達(dá)水平在1μM和5μM的紅景天苷作用48h后上調(diào)接近1倍：Western blot結(jié)果表明紅景天苷能劑量依賴和時(shí)間依賴地上調(diào)ROB和MG63細(xì)胞中的BMP2蛋白表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

9、結(jié)果表明紅景天苷能劑量依賴地抑制去勢大鼠的骨量減少，與陽性藥物雷洛昔芬效果相當(dāng)，但對于破骨細(xì)胞的活性則無顯著的抑制作用，間接地說明了紅景天苷增加骨量不是依賴于抑制骨吸收而是促進(jìn)成骨性的骨形成。這些結(jié)果顯示了該化合物具有良好的防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用前景。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明，紅景天苷在細(xì)胞水平上具有顯著的延緩衰老的作用，這一方面得益于紅景天苷的抗氧化作用，能有效減少ROS引起的損傷，另一方面紅景天苷本身可能具有促進(jìn)DNA損