紅景天苷的超高壓提取及其藥理活性的初步研究.pdf

1、紅景天(Rhodiola rosea)系景天科紅景天屬多年生草本植物，具有安眠鎮(zhèn)靜、耐缺氧、延緩衰老、抗輻射等藥理活性，是著名的一味滋補(bǔ)藥材，其強(qiáng)壯機(jī)體之功效可媲美人參、刺五加，在我國(guó)中醫(yī)臨床上有著悠久的應(yīng)用歷史。此藥材含有紅景天苷、酪醇等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤的藥理活性，近幾年國(guó)內(nèi)外有大量有關(guān)于其藥理作用的報(bào)道。
　　 但因當(dāng)前提取技術(shù)發(fā)展的限制，傳統(tǒng)的提取技術(shù)在提取效率、提取后活性方面存在一定的不足。超高壓提取技

2、術(shù)的出現(xiàn)，很好的彌補(bǔ)了這些缺陷，相比傳統(tǒng)提取方法，超高壓提取具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如溶劑消耗少、室溫下即可提取、提取率高、節(jié)能等等。近幾年，國(guó)內(nèi)外有大量相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道使用超高壓提取法用于中藥材有效成分的提取，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果普遍優(yōu)于常規(guī)方法，但尚未見超高壓提取技術(shù)應(yīng)用于紅景天藥材的提取的報(bào)道，對(duì)超高壓提取紅景天中紅景天苷的最優(yōu)工藝尚不明確;紅景天抗氧化活性研究大多集中于常規(guī)提取方法的提取物及活性單體化合物上，尚未有紅景天超高壓提取物抗氧化活性的報(bào)道

3、，且未見關(guān)于紅景天超高壓提取法與其他常規(guī)提取法所得提取物之間抗氧化活性相對(duì)強(qiáng)弱的比較;此外，很多研究人員已對(duì)紅景天常規(guī)提取法所得提取物及其主要活性成分紅景天苷體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性做過研究，但未見關(guān)于紅景天超高壓提取法與常規(guī)提取法所得提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制活性差異比較的相關(guān)報(bào)道。
　　 因此，本文擬采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法(CCD-RSM)優(yōu)選出超高壓提取紅景天中紅景天苷的最佳工藝條件，并在同等提取條件下，與其他常見提取技

4、術(shù)就提取得率進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)各提取方法的優(yōu)劣;同時(shí)對(duì)超高壓提取和其他常規(guī)提取技術(shù)的粗提取物就體外抗氧化活性進(jìn)行比較研究，運(yùn)用不同的測(cè)定方法，建立一系列體外抗氧化體系，來測(cè)定這四種提取物及紅景天苷對(duì)DPPH·、O2-、OH·等自由基的清除能力，及對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制活性，還原能力和總抗氧化能力，綜合評(píng)價(jià)四種提取方法所得紅景天粗提取物和紅景天苷單體的抗氧化活性強(qiáng)弱大小;此外，選取體外培養(yǎng)的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞作為研

5、究對(duì)象，采用MTT法觀察紅景天超高壓提取物和其他三種常規(guī)提取法所得提取物對(duì)A549細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞的體外增殖抑制作用的差異，初步評(píng)價(jià)四種提取物細(xì)胞抑制活性的強(qiáng)弱。
　　 研究目的:
　　 1、采用CCD-RSM原理優(yōu)選出超高壓提取紅景天苷的最佳工藝條件，并就紅景天苷得率與其他提取法進(jìn)行比較分析，初步評(píng)價(jià)各提取法之優(yōu)劣。
　　 2、綜合比較紅景天各提取方法所得粗提物的體外抗氧化活性，并就活性差異產(chǎn)生的原因進(jìn)行初

6、步討論。
　　 3、利用MTT法初步比較四種提取方法所得紅景天粗提取對(duì)A549和CNE-2細(xì)胞體外增殖抑制活性差異。
　　 研究方法:
　　 1、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面積法優(yōu)化超高壓提取紅景天中紅景天苷
　　 ①、將紅景天藥材預(yù)處理后，置于密實(shí)袋中，按相應(yīng)料液比加入預(yù)設(shè)濃度的提取溶劑，放入等靜壓機(jī)，按照預(yù)設(shè)參數(shù)進(jìn)行操作。將粗提液高速離心，直至變得澄清，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽濾。②、通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選定液相色

7、譜儀的色譜條件，配制一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同樣條件下測(cè)定待測(cè)樣品溶液并計(jì)算平均峰面積，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅景天苷提取率。③、借助Design-Expert8.0.0軟件依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線，考察所擬合的響應(yīng)面曲線的形狀，根據(jù)響應(yīng)面圖對(duì)任何兩個(gè)考察因素之間的交互關(guān)系進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，確定最佳工藝。④、在同等條件下，對(duì)超高壓提取法和其他三種常規(guī)方法進(jìn)行提取率的比較，綜合評(píng)定各提取法的優(yōu)劣。
　　

8、 2、各提取法所得提取物及紅景天苷體外抗氧化活性的測(cè)定
　　 ①、按預(yù)設(shè)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，分別采用超高壓提取、回流提取、超聲輔助提取及微波提取等四種提取方法對(duì)紅景天進(jìn)行提取操作，得各提取方法的粗提液，分別用英文簡(jiǎn)寫UPER、RER、UER、MER表示，作為待測(cè)樣品溶液;另配制呈梯度濃度的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同樣作為待測(cè)樣品溶液;②、分別配制DPPH·反應(yīng)液、產(chǎn)生O2-的NADH-NBT-PMS溶液體系、產(chǎn)生OH·的Fe3+-EDTA

9、-抗壞血酸-H2O2溶液體系、以卵黃脂蛋白作底物的脂質(zhì)過氧化模型反應(yīng)體系、K3Fe(CN)6-Fe3+還原能力模型反應(yīng)體系、β-胡蘿卜素-亞油酸自氧化體系，按比例加入待測(cè)樣品溶液，于相應(yīng)的反應(yīng)條件下作用后，在特定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，按相應(yīng)公式計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH、O2-、OH·自由基的清除率，對(duì)脂質(zhì)的過氧化抑制能力以及還原能力、總抗氧化能力;③、計(jì)算待測(cè)樣品及陽(yáng)性對(duì)照品在各抗氧化活性測(cè)定指標(biāo)下的IC50值，不同濃度的四種粗提液在某一抗

10、氧化體系中的抗氧化活性采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì)方差分析，先做方差齊性檢驗(yàn):方差齊同，采用SNK-q法進(jìn)行兩兩之間全面比較;方差不齊，采用Dunnett T3法進(jìn)行組間兩兩比較，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、四種紅景天粗提物溶液對(duì)A549和CNE-2細(xì)胞增殖抑制作用的比較
　　 ①、按預(yù)設(shè)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，分別采用超高壓提取、回流提取、超聲輔助提取及微波提取等四種提取方法對(duì)紅景天進(jìn)行提取操作，得

11、各提取方法的粗提液，分別以英文簡(jiǎn)寫UPER、RER、UER、MER表示，作為待測(cè)樣品溶液;以5-氟尿嘧啶（5-Fu）作陽(yáng)性對(duì)照藥物;②、MTT法繪制A549和CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，確定兩腫瘤細(xì)胞系最佳生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)間點(diǎn)為培養(yǎng)后48h;③、利用MTT法進(jìn)一步測(cè)定加藥后72h各處理組的細(xì)胞增殖抑制率，然后計(jì)算四種待測(cè)樣品及5-Fu對(duì)兩細(xì)胞系增殖抑制的IC50值。不同濃度的四種粗提液處理A549和CNE-2細(xì)胞后的體外增殖抑制率采用兩因素多水

12、平析因設(shè)計(jì)方差分析，先做方差齊性檢驗(yàn):方差齊同，采用SNK-q法進(jìn)行兩兩之間全面比較;方差不齊，采用Dunnett T3法進(jìn)行組間兩兩比較，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面積法優(yōu)化超高壓提取紅景天中紅景天苷
　　 超高壓提取紅景天中紅景天苷的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度77.3％、液固比為29.5、提取壓力為255.5Mpa，此時(shí)紅景天中紅景天苷提

13、取率的最大估計(jì)值Y=9.46 mg·g-1;超高壓提取法提取紅景天中紅景天苷的提取率(9.29 mg·g-1)、要高于其他三種提取方法（回流:7.10mg·g-1;超聲:7.72mg·g-1;微波:8.48mg·g-1），且提取所用時(shí)間(2 min)明顯短于回流提取法(2 h)和超聲提取法(30min)。
　　 2、各提取方法所得提取物及紅景天苷單體的體外抗氧化活性測(cè)定
　　 本實(shí)驗(yàn)共模擬了六種體外自由基發(fā)生體系，包括D

14、PPH·、NBT-NADH-PMS、Fe3+-EDTA-抗壞血酸-H2O2、卵黃脂質(zhì)過氧化模型反應(yīng)體系、還原鐵氰化鉀以及β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系，分別測(cè)定了四種提取法所得粗提物溶液UPER、UER、MER、RER對(duì)DPPH·、O2-·、OH·三種自由基的清除能力，以及它們對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力、還原能力、總抗氧化活性，以此來比較研究不同提取技術(shù)提取得到的紅景天粗提物的體外抗氧化活性。
　　 綜合六種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的

15、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①、除O2-·清除活性四種粗提物無顯著差異外，UPER對(duì)DPPH·、OH·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力、總抗氧化活性五個(gè)測(cè)定指標(biāo)均大于MER、RER; UPER在OH·清除活性、抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力三個(gè)指標(biāo)方面優(yōu)于UER，在DPPH·、總抗氧化活性兩個(gè)指標(biāo)方面與UER相當(dāng)。②、UER在DPPH·清除活性、總抗氧化活性兩個(gè)測(cè)定指標(biāo)上均要大于MER，而在OH·、O2-·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力四

16、個(gè)指標(biāo)方面與MER大小相當(dāng);除O2-·清除活性外，在其它五個(gè)體外抗氧化活性測(cè)定指標(biāo)上UER均要強(qiáng)于RER。③、MER在DPPH·、OH·清除活性以及抑制脂質(zhì)過氧化能力、還原能力四個(gè)指標(biāo)上表現(xiàn)得優(yōu)于RER，而在O2-·清除活性、總抗氧化活性兩個(gè)指標(biāo)方面MER、RER活性大小相當(dāng)。
　　 因此由以上比較可以對(duì)四種提取方法所得紅景天粗提物體外抗氧化活性進(jìn)行總體評(píng)價(jià)，得出以下初步結(jié)論:UPER＞UER＞MER＞RER。
　　 3

17、、四種紅景天粗提物溶液對(duì)A549和CNE-2細(xì)胞增殖抑制作用的比較
　　 MTT法檢測(cè)結(jié)果表明:①、四種粗提物溶液UPER、UER、MER、RER對(duì)A549細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50依次為2.088mg/ml、2.237mg/ml、1.974mg/ml、2.931 mg/ml，故體外抗腫瘤活性大小順序依次為:MER＞UPER＞UER＞RER。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果同樣證明，UPER、UER、MER兩兩之間無顯著性差異(P＜0.05)

18、，而UPER、UER、MER三者之一與RER之間均有顯著性差異(P＞0.05)。故UPER、UER、MER對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制活性相當(dāng)，且均要強(qiáng)于RER。②、UPER、UER、MER、RER對(duì)CNE-2細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50依次為2.239mg/ml、2.385mg/ml、2.277mg/ml、2.782mg/ml。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，UPER、MER兩者間的體外增殖抑制活性無顯著性差異(P＜0.05)，UER與MER間無顯著

19、性差異(P＜0.05)，UPER與UER間有顯著性差異(P＞0.05)，而UPER、UER、MER三者之一與RER之間均有顯著性差異(P＞0.05)，故UPER、UER、MER三者對(duì)CNE-2細(xì)胞株增殖抑制活性相當(dāng)，而RER的抑制活性要低于前三者。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)、從紅景天中提取紅景天苷，就提取得率而言，超高壓提取法要優(yōu)于回流提取、微波提取法和超聲輔助提取法。
　　 (2)、與其他三者常規(guī)提取法相